ЯЖТЕ. Чудинов, В.А. Платонов, А.В. Александрова, С.Н. Елански
Наскоро беше показано, че аскомицетната гъба Ilyonectria crassa е способна да зарази картофените клубени. Тази работа е първата, която анализира биологичните характеристики и устойчивостта на някои фунгициди от щама I. crassa, изолиран от картофи. Последователностите на специфичните за видовете райони на щама „картофи“ съвпаднаха с тези, получени по-рано за гъби, изолирани от корените на нарцис, женшен, трепетлика и бук, луковици на лилии и листа от лалета. Очевидно много диви и градински растения могат да бъдат резервати от I. crassa. Изследваният щам зарази резенчета домати и картофи, но не зарази целия плод домати и непокътнати картофени грудки. Това показва, че I. crassa е ранен паразит. Оценката на резистентност към флудиоксонил, дифеноконазол и азоксистробин върху хранителна среда показа висока ефективност на тези лекарства.
Индикаторът EC50 (концентрацията на фунгицида, която се забавя с 2 пъти скоростта на радиален растеж на колонията спрямо контрола на нефунгицида) е равен на 0.4; 7.4 и 4 mg / l, съответно. Възможността за развитие на болестта, причинена от I. crassa, трябва да се вземе предвид при фитопатологичната оценка на картофените клубени и разработването на мерки за растителна защита.
Развитието на фитопатогенни микроорганизми води до големи загуби на всички етапи на отглеждане и съхранение на картофи. При планирането на защитни мерки като правило се вземат предвид добре познати патогени, като видове от родовете Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora и др. През последните години обаче се появяват все повече доклади за появата на нови фитопатогенни микроорганизми върху картофите. Тяхната биология е слабо проучена, ефективността на фунгицидите, използвани върху картофите по отношение на тях, е неизвестна, диагностичните методи не са разработени. С масовото развитие те са способни да причинят значителни щети на картофената реколта. Един от тези микроорганизми е аскомицетната гъба Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, открита за първи път от авторите върху картофени клубени (Chudinova et al., 2019).
Тази работа представя резултатите от анализа на щама I. crassa, изолиран от картофени клубени. Изследвана е морфологията на колониите и мицелните структури на I. crassa, нуклеотидни последователности на специфични за вида ДНК региони, вирулентност към картофи и домати и устойчивост към някои популярни фунгициди.
Материали и методи
Използвахме щама I. crassa 18KSuPT2, изолиран през 2018 г. от заразения картофен клубен, отглеждан в региона на Кострома. Грудката е била засегната от тип сухо гниене с кухина, покрита със светлокафяв мицел. С помощта на стерилна дисекционна игла гъбичният мицел се прехвърля в чаша на Петри с агарова среда (бирена мъст 10%, агар 1.5%, пеницилин 1000 U / ml). Плаките се инкубират на тъмно при 24 ° С.
Светлинен микроскоп Leica DM2500 с цифров фотоапарат ICC50 HD и бинокулярен микроскоп Leica M80 с цифров фотоапарат IC80HD (Leica Microsystems, Германия) бяха използвани за фотографиране, оценка на размера и морфологията на спорите и споровите органи.
За да се изолира ДНК, гъбичният мицел се отглежда в течна грахова среда, след това се замразява в течен азот, хомогенизира се, инкубира се в CTAB буфер, пречиства се с хлороформ и се промива два пъти със 2% алкохол.
Методът за екстракция на ДНК е описан подробно в статията на Kutuzova et al. (2017).
За да се определят видовете чрез молекулярни методи и да се сравнят с други известни щамове I. crassa, PCR се извършва с праймери, които позволяват амплификация на специфични за вида ДНК региони: ITS1-5,8S-ITS2 (праймери ITS5 / ITS4, White et al., 1990), генни региони b -тубулин (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) и фактор на удължаване на транслацията 1α (tef1α) (праймери EF1-728F / EF1-986R, Carbone and Kohn, 1999). Ампликони с желаната дължина бяха извлечени от гела с помощта на Evrogen CleanUp комплект. Амплифицираните области бяха секвенирани с помощта на BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, USA) върху автоматизиран секвенсор Applied Biosystems 3730 xl (Applied Biosystems, CA, USA). Получените нуклеотидни последователности бяха използвани за търсене на съвпадение в базата данни GenBank на Националния център за биотехнологична информация на САЩ (NCBI). Филогенетичният анализ беше извършен с помощта на програмата MEGA 6 (Tamura et al., 2013).
Определянето на вирулентността се извършва върху цели зелени плодове на едроплодни домати (сорт Dubrava) и картофени клубени (сорт Gala). В допълнение, за да симулираме увреждане на повредени плодове и грудки, използвахме филийки от същите плодове и грудки. Резенчета грудки се поставяха във влажни камери, които бяха петриеви чинии с мокра филтърна хартия отдолу. Върху хартията беше поставен предметно стъкло, върху което от своя страна бяха поставени резенчета грудки или плодове. Цели грудки и плодове също бяха поставени в контейнери с мокра филтърна хартия на дъното. В центъра на среза (или върху непокътнатата повърхност на грудката или плода) се поставя парче агар (5 × 5 mm) с гъбични хифи след 5-дневно отглеждане върху агар от пивна мъст.
Оценката на устойчивостта на гъбични щамове към фунгициди е извършена в лабораторни условия върху хранителна среда в агар. Изследвахме чувствителността към фунгицидни лекарства Maxim, KS (активна съставка флудиоксонил, 25 g / l), Quadris, KS (азоксистробин 250 g / l), Scor, EC (дифеноконазол 250 g / l) (Държавен каталог ..., 2020). Извършена е оценка в чашките на Петри върху пивна агарна среда с добавяне на изследваните лекарства при концентрации на активното вещество 0.1; един; 1 ppm (mg / L) (за флудиоксонил и дифеноконазол), 10; десет; 1 ppm (за азоксистробин) и в среда без фунгицид (контрол). Фунгицидът се добавя към разтопената и охладена до 10 ° С среда, след което средата се излива в чашките на Петри. Агарен блок с гъбичен мицел се поставя в центъра на Петри и се култивира при температура 100 ° С на тъмно. След 60 дни инкубация диаметрите на колониите се измерват в две взаимно перпендикулярни посоки; резултатите от измерванията за всяка колония бяха осреднени. Експериментите са проведени в три екземпляра. Въз основа на резултатите от анализите се изчислява ЕС24, равна на концентрацията на фунгицида, което намалява наполовина скоростта на радиален растеж на колонията спрямо фунгицидния контрол.
Резултати и дискусия
В чиниите на Петри с пивна агар гъбата образува колонии с бял флокулентен мицел. Средата под мицела стана червеникавокафява. Когато средата изсъхне, гъбата образува спори от два вида върху единични и агрегирани конидиофори в малки спородохии. Макроконидиите са удължени, цилиндрични, с една до три прегради, средна дължина 27.2 µm с диапазон от стойности от 23.2 до 32.2 µm, ширина - до 4.9 µm (фиг. 1). Средната дължина на микроконидиите е 14.3 µm с диапазон от стойности от 10.3 до 18.1 µm, ширината е до 4.0 µm. Всички макро- и микроморфологични признаци се вписват в диапазона на вариация на вида Ilyonectria crassa (Cabral et al., 2012).
Последователностите на специфични за видовете ДНК области (ITS, b-тубулин, TEF 1α) напълно съвпаднаха с последователностите на щамовете I. crassa, които изследвахме по-рано (Chudinova et al., 2019, Таблица 1). За да се изследва разпространението на I. crassa в други региони и да се анализира спектърът на засегнатите култури, бяха анализирани аналогични ДНК последователности в базата данни GenBank (Таблица 1). Припокриването беше 86 до 100%. Последователностите на трите области на ДНК на щама „картофи“ I. crassa са идентични с последователностите на щамовете, изолирани от луковицата на лилията и корените на нарциса в Холандия и от корена на женшен в Канада. Не успяхме да намерим други щамове на I. crassa с три анализирани подобни последователности в отворени бази данни. Анализът на депозираните ITS и b-тубулинови последователности обаче показа наличието на I. crassa върху листата на лалетата във Великобритания. Гъби с подобна ITS последователност са идентифицирани при анализа на микобиотата на трепетликовите корени в Канада и буковите корени в Италия, картофените клубени в Саудитска Арабия (Таблица 1). Резултатите от това проучване показват, че I. crassa има глобално разпространение и е в състояние да зарази различни растителни видове.
При определяне на патогенността върху филийките домат и картофи на 5-ия ден диаметърът на лезията достига 1.5 см. Изследваният щам не заразява целия плод домати и непокътнати картофени грудки. Чашелистчетата обаче бяха засегнати върху домата. За да се изключи възможността за замърсяване от мицела, развит върху парче от картофени клубени, в чиста култура се изолира гъбен изолат. Той беше напълно идентичен с родителския щам. Очевидно I. crassa е ранен паразит.
Третирането преди засаждане на семенните грудки с фунгициди намалява развитието на болести по растенията през вегетационния период. За избора на ефективни фунгициди е важно да се прецени кои от тях са ефективни срещу I. сrassa. Работата изследва широко разпространените активни вещества на фунгицидите - флудиоксонил, азоксистробин, дифеноконазол. Флудиоксонил е включен в няколко смеси, използвани за дресиране на семена и семенни клубени преди засаждане. Fludioxonil (Maxim) също се използва за третиране на клубени на семена преди съхранение. Дифеноконазол и азоксистробин също са включени в редица препарати, използвани за обработка на семенен материал, както и в препарати, предназначени за обработка на вегетативни растения (Държавен каталог ..., 2020).
Скоростта на растеж на I. crassa е изследвана върху среда (фиг. 2) с различни концентрации на активни вещества: флудиоксонил (EC50 = 0.4 ppm), азоксистробин (EC50 = 4 ppm) и дифеноконазол (EC50 = 7.4 ppm) (таблица 2). Тези препарати могат да се считат за много ефективни срещу I. crassa, тъй като техният EC50 е значително по-нисък от препоръчителната концентрация на препарата в работната течност, използвана за обработка на грудки. Според Държавния каталог ... (2020) концентрацията на флудиоксонил в течността за обработка на картофени клубени е от 500 до 1000 ppm, азоксистробин (в течността за обработка на дъното на браздата) - 3750-9375 ppm, дифеноконазол (в течността за третиране на вегетативни растения) - 187.5– 625 ppm.
Таблица 1. Сходство на последователностите на специфични за вида последователности на щам 18KSuPT2 и щамове на Ilyonectria crassa, налични в базата данни Genbank
деформация | Приемно растение, място на екскреция | Поредни номера, депозирани в GenBank, процент на прилики | Връзка | ||
ИТС | β-тубулин | TEF 1α | |||
17KSPT1 и 18KSuPT2 | Картофена грудка, Костромска област | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Чудинова и др., 2019, тази работа |
CBS 158/31 | Нарцисови корени, Холандия | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Кабрал и др., 2012 г |
CBS 139/30 | Луковица на лилия, Холандия | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Корен от женшен, Канада | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | Лист от лале, Великобритания | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | Дентън, Дентън, 2014 г. |
MT294410 | Корените на аспен, Канада | MT294410 100 | ND | ND | Рамсфийлд и др., 2020 |
ER1937 | Бук, Италия | KR019363 99.65 | ND | ND | Тицани, Хаеги, Мота. Директно подаване |
KAUF19 | Картофена грудка, Саудитска Арабия | HE649390 98.3 | ND | ND | Гашгари, Гербави, 2013 г. |
ND = не се депозира
Таблица 2. Устойчивост на Ilyonectria crassa към фунгициди
(активно вещество) | EC50, ppm | ||||
3 дни | 5 дни | 7 дни | |||
Контрол | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Quadris, KS (fsoxystrobin) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Максим, KS (флудиоксонил) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Skor, EC (дифеноконазол) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
В нашата работа щамовете I. crassa бяха изолирани от картофени клубени в Костромския и Московския региони (Chudinova et al., 2019). Висок процент гъбични щамове с ITS последователности, идентични на I. crassa, беше разкрит при анализ на микобиотата на картофените клубени в Саудитска Арабия (Gashgari and Gherbawy, 2013). Очевидно I. crassa не е толкова рядък за картофите, колкото може да изглежда. Нашите експерименти показаха, че гъбата може да зарази увредените плодове от домати. От литературата е известно, че I. crassa е способен да се развива в почвата сапротрофно (Moll et al., 2016), както и да засяга различни растения, дори таксономично отдалечени като нарциси, лилии, женшен, трепетлика и бук (Таблица 1). един). Очевидно много диви и градински растения могат да бъдат резервати от I. crassa. Горното показва, че при разработването на защитни мерки е необходимо да се вземе предвид възможността за засягане на картофените клубени с тази гъба. Широко разпространените препарати за лечение на картофени грудки, съдържащи флудиоксонил, азоксистробин и дифеноконазол, показват висока фунгицидна ефективност срещу I. crassa.
Тази работа беше подкрепена от Руската фондация за фундаментални изследвания (грант № 20-016-00139).
Статията е публикувана в списание "Бюлетин за растителна защита", 2020, 103 (3)