Д. Ю. Рязанцев, Е. М. Чудинова, Л. Ю. Кокаева, С. Н. Елански, П. Н. Балабко, Г. Л. Белова, С. К. Завриев
Фитопатогенната гъба Colletotrichum coccodes причинява опасни болести по картофите и доматите, известни като антракноза и грудно черно петно. По морфологични характеристики те често са трудни за разграничаване от заболявания, причинени от други микроорганизми; при плодовете със зелен домат болестта може да бъде безсимптомна, проявявайки се само при зрели червени плодове. За бърза и точна диагностика на патогена се предлага система за PCR тест в реално време. За да се разработи тестова система, беше определена нуклеотидната последователност на гена глицерол трифосфат дехидрогеназа от 45 C. щамове кокоди, изолирани от картофени клубени в различни региони на Русия.
Въз основа на получените резултати и анализ на подобни последователности на други видове, налични в базата данни GenBank, са проектирани специфичните за вида праймери и сонда за C. coccodes. За да се провери специфичността на създадената тестова система, PCR беше извършена с ДНК, изолирана от чисти култури от 15 различни вида паразитни и сапротрофни гъби, свързани с растения домати и картофи (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Наличието на ДНК на Colletotrichum coccodes беше определено при прагов цикъл от 20–27, докато други видове бяха открити след 40 цикъла или не бяха открити. Тестовата система дава възможност за надеждно откриване на концентрации на ДНК на C. coccodes над 0.01 ng / mm3 в анализираната PCR смес. Използвайки разработената система за изпитване, беше изследвано наличието на C. coccodes в листата на домати със симптоми на гъбични заболявания и в картофени клубени без външни симптоми на заболяването. Листа със симптоми на гъбична инфекция са събрани от две различни полета в Краснодарския край, грудки - от полета в Костромска, Московска, Калужска, Нижегородска области. В Краснодарска територия е открит един лист домат, съдържащ ДНК на C. coccodes; значително присъствие на ДНК на този патоген беше открито в 5 проби от клубени, отглеждани в регионите Кострома, Москва, Калуга.
въведение
Гъбите от рода Colletotrichum са опасни фитопатогени, засягащи зърнени култури, зеленчуци, билки, многогодишни плодови и горски растения. Един от вездесъщите видове от този род, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Хюз, е причинител на антракноза и черно петно от картофи и домати и причинява заболявания на редица други растения от семейство Solanaceae, вкл. плевели (Dillard, 1992). C. coccodes инфектира всички подземни части на растението, основите на стъблата, листата и плодовете (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994). По кората на заразените картофени клубени се наблюдава развитието на сиви петна с неясно изразени ръбове, върху които ясно се виждат черни петна от спороношение и микросклероция. По време на съхранението в пулпата на клубените могат да се образуват язви с омекотено съдържание, т.е. болестта навлиза в антракнозната фаза, която обаче е изключително рядка.
В същото време симптомите на антракноза (кожни язви с малки черни точки) са типични за доматените плодове. На листата симптомите на C. coccodes се появяват като тъмнокафяви петна, обикновено граничещи с жълта тъкан (Johnson, 1994).
Развитието на черно петно по клубените разваля външния им вид, което е особено изразено при продажба на измити картофи с червена кора. Пилингът на кората води до излишно изпаряване и увеличаване на загубите при съхранение (Hunger, McIntyre, 1979). Увреждането на други растителни органи води до загуби на добив, което се отбелязва както на открито, така и на затворено място (Johnson, 1994; Tsror et al., 1999). Болестите, причинени от C. coccodes, са често срещани в почти всички региони за производство на картофи по света, включително Русия (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). Контролът на тези заболявания е труден поради недостатъчната ефективност на съществуващите фунгициди срещу C. coccodes и липсата на устойчиви сортове (Read, Hide, 1995).
Инокулумът на C. coccodes може да се запази в семенните грудки (Read, Hide, 1988; Johnson et al., 1997), доматите (Ben-Daniel et al., 2010), оцеляват дълго време в почвата, върху растителните остатъци (Dillard, 1990 ; Dillard and Cobb, 1993) и при плевели (Raid and Pennypacker, 1987). Работите на редица автори (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) показват, че развитието на болестта при картофите и доматите до голяма степен зависи от наличието на инокулум в семената и почва. Следователно, за да се минимизират загубите от болестта, е необходимо да се диагностицират (включително количествено) пропагулите на гъбичките в семенния материал, в почвата, в семенните картофени грудки и семената на доматите, поставени за съхранение. Морфологичната диагностика в почвата и растителния материал може да се извърши само от наличието на микросклероции, които обаче се срещат и при други видове гъби.
Симптомите по грудките са много подобни на сребристата струпясване, причинена от гъбичките Helminthosporium solani. Изолирането на Colletotrichum coccodes и Helminthosporium solani в чиста култура е доста трудно и отнема много време поради бавния растеж на хранителна среда. За бързо идентифициране на кокодовете Colletotrichum е необходимо да се използват инструментални диагностични методи. Най-удобният метод е полимеразна верижна реакция (PCR) и нейната модификация - PCR в реално време. В момента в Европа и Съединените щати се използва тестова система, разработена от британски изследователи (Cullen et al., 2002) за ITS1 региона на рДНК. Използването му показа добри резултати при анализа на руските изолати (Belov et al, 2018). Въпреки това, C. coccodes е силно променлив и откриването му от една ДНК последователност може да доведе до фалшиво отрицателни резултати. За по-надеждна диагноза е необходим анализ на няколко специфични за вида ДНК последователности, във връзка с които сме разработили оригинална тестова система, която позволява да се идентифицират C. coccodes по последователността на гена глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа.
Материали и методи
За да оценим ефективността и специфичността на създадените тестови системи, използвахме чисти култури от 15 вида гъби, изолирани от авторите от болни проби от листа и плодове домати, картофени клубени (Таблица 1). За изолация са взети органи на растения със симптоми на гъбична инфекция, не повече от един орган на храст.
Резен грудка с кора, резен плод домат и засегнато листо се поставят под бинокулярен микроскоп, след което мицел, спори или парче тъкан се прехвърлят в агарова среда (пивна агар) в чаша на Петри с наточена дисекционна игла. Изолатите се съхраняват върху агарен наклон в епруветки при 4 ° С.
Проби от листа от домати със симптоми на гъбични заболявания, предназначени за анализ, веднага след събирането (на полето) се поставят в 70% етилов алкохол, в който се съхраняват до изолиране на ДНК. Картофени клубени бяха доставени в лабораторията, обелени (2 × 1 см парче) от тях и замразени при –20 ° С. Съхранява се замразен до изолиране на ДНК.
Чисти култури от гъбички за изолиране на ДНК се отглеждат в течна грахова среда. Мицелът на гъбичките се отстранява от течната среда, изсушава се върху филтърна хартия, замразява се в течен азот, хомогенизира се, инкубира се в CTAB буфер, пречиства се с хлороформ, утаява се със смес от изопропанол и 0.5 М калиев ацетат и се промива два пъти със 2% алкохол. Получената ДНК се разтваря в дейонизирана вода и се съхранява при –70 ° С (Kutuzova et al., 20). Концентрацията на ДНК се измерва с помощта на комплект за количествено определяне на ДНК за двуверижна ДНК на Qubit 2017 (Qiagen, Германия). Алкохолизираните и замразени проби се стриват в течен азот, след което се извършва екстракция на ДНК, както е описано по-горе (за мицела на чисти гъбични култури).
Таблица 1. Произход на използваните гъбични щамове
Име на гъби | растение, орган | Място на избор |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | картофена грудка | Костромска област, картофени клубени от 1-во полско поколение, сорт Red Scarlett |
Кокототрихови кокоди 4 | картофено листо | Представител Мари Ел, Йошкар-Ола |
Helminthosporium solani | картофена грудка | Област Магадан, поз. Палатка, картофена грудка |
Cladosporium fulvum | лист домат | Московска област, едроплоден домат |
Alternaria tomatophila | доматен плод | предаден от персонала на лабораторията по микология и фитопатология на Всеруския изследователски институт по растителна защита |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | доматен плод | Краснодарска територия, район Кримски, клас Крем |
Fusarium oxysporum | пшеничен корен | Московска област |
PCR се провежда на DTprime усилвател (DNA-Technology). За PCR бяха използвани оригинални праймери и сонда за специфичния за вида регион на глицерол трифосфат дехидрогеназния ген: праймер Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, обратен праймер Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1. Праймерите усилват 213 bp регион.
Реакцията отне 50 ng обща ДНК (при анализа на листа и клубени) и 10 ng (при анализа на ДНК на чисти култури от гъби). Реакционната смес (35 μl) се разделя от парафинов слой на две части: долната (20 μl) съдържа 2 μl 10 × реакционен буфер (750 mM Tris-HCl, рН 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% Tween- 20), 0.5 тМ от всеки дезоксинуклеотид трифосфат, 7 пмол от всеки праймер и 4 пмол от хидролизуема флуоресцентна сонда; горният съдържа 1 μl 10 × PCR буфер и 1 U Taq полимераза.
Разделянето на сместа с парафин позволява епруветките да се съхраняват дълго време при температура 5 ° C и да осигурят горещ старт за PCR след нагряването им в продължение на 10 минути при температура над 80 ° C. PCR се извършва съгласно следната програма: 94.0 ° C - 90 s (1 цикъл); 94.0 ° C - 30 s; 64.0 ° C - 15 s (5 цикъла); 94.0 ° C - 10 s; 64.0 ° C - 15 s (45 цикъла); 10.0 ° C - съхранение.
Резултати и дискусия
Последователностите на гена на глицерол трифосфат дехидрогеназа бяха определени в 45 щама, изолирани от листа, стъбла, картофени клубени и плодове от домати (Kutuzova, 2018) в различни региони на Русия. Изследваните последователности на всички щамове бяха разделени на 2 групи, различаващи се по два нуклеотида. Нуклеотидните последователности на представители на двете групи под номера KY496634 и KY496635 се депозират в GenBank.
Праймерите coc70gdf, coc280gdr и cocgdz сондата, проектирани на тяхна основа, бяха проверени с помощта на програмата BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) върху всички последователности на гена глицерол трифосфат дехидрогеназа на видове от рода Colletotrichum и други организми, налични в базата данни GenBank.
Не са открити ДНК области на други организми, силно хомоложни на праймери и сонда.
Чувствителността на тестовата система беше проверена с помощта на проби с различни концентрации на ДНК на C. coccodes, ДНК на картофени листа, заразени с антракноза (събрани през 2017 г. в Мари Ел, сорт Red Scarlett), и кора от клубени, засегнати от черно петно (събрани в района на Кострома, сорт Red Scarlett, Таблица 2). За да се потвърди наличието на ДНК в грудки и картофени листа, щамовете C. coccodes бяха изолирани от тях в чисти култури.
Резултатите от анализа на чувствителността на тестовата система показват, че тя може да се използва за успешно диагностициране на наличието на ДНК на C. coccodes в проба, когато общото й съдържание в PCR сместа е повече от 0.05 ng. Това е напълно достатъчно за откриване, тъй като една склероция съдържа средно 0.131 ng, а една спора съдържа около 0.04 ng ДНК (Cullen et al., 2002). Тестовата система, разработена от английската група (Cullen et al., 2002), показва подобна чувствителност (прагов цикъл 34 при 0.05 ng ДНК и 37 при 0.005 ng).
Анализът на естествени проби, съдържащи C. coccodes, във всички случаи даде възможност надеждно да се разкрие присъствието му в пробата (Таблица 2). Предложеният метод за изолиране на ДНК е приложим и при анализа на естествени растителни проби.
Таблица 2. Определяне на чувствителността на предложената тестова система за идентификация на кокодовете Colletotrichum за PCR в реално време
проба | Количество ДНК в проба *, ng | Прагов цикъл | В. откриване на кокодове |
---|---|---|---|
Кокоди на Mycelium Colletotrichum | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Корена грудка 1 | 50 | 32 | + |
Корена грудка 2 | 50 | 30 | + |
Корена грудка 3 | 50 | 31.5 | + |
Картофено листо | 50 | 29.5 | + |
Забележка. * В смес от PCR продукти.
Специфичността на тестовата система е тествана върху ДНК проби, извлечени от 15 вида гъби. Всички щамове гъби са изолирани от авторите от засегнати и здрави плодове и листа от домати, картофени клубени; един щам е изолиран от пшеничен корен (Таблица 1). Сред видовете, изолирани от повърхността на плодовете, има и видове, които не са патогенни за домати (например Phellinus ferrugineovelutinus).
Проучванията показват, че ДНК на C. coccodes е била открита при прагов цикъл от 20–27, докато други гъбични видове не са били открити или са дали сигнал след цикъл 40, което може да се отдаде на неспецифичен шумов ефект (Таблица 3).
Таблица 3. Проверка на тестовата система за различни видове гъби
Име на гъби | Прагов цикъл |
Коккотрици на Colletotrichum 1 | 20.9 |
В. кокодове 2 | 22.6 |
В. кокодове 3 | 23 |
В. кокодове 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. вертицилиум | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
Фомопсис фазеоли | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
А. доматифила | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelutinus | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Кладоспориум кладоспориоиди | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
Penicillium Sp. | > 40 |
Забележка. * Количеството ДНК във всички проби е 10 ng.
Разработената система за тестове беше използвана за идентифициране на C. coccodes в проби от листа от домати със симптоми на некротрофни патогени и грудки от семенни картофи без видими симптоми. За проучването взехме семенни клубени от различни сортове, отглеждани в Кострома, Москва, Калуга, Нижни Новгород. Наличието на ДНК на C. coccodes се счита за значително в пробите, при чийто анализ праговият цикъл не надвишава 35. Тази прагова стойност е избрана въз основа на надеждното определяне на 0.05 ng на ДНК на C. coccodes (прагов цикъл 33.5, Таблица 2) и факта, че прагови цикли над 40, беше диагностицирана неспецифична ДНК на някои други видове гъби. С този подход значителното присъствие на ДНК на C. coccodes беше открито в 5 проби от клубени, отглеждани в областите Кострома, Москва, Калуга и в един лист от домати от област Йейск в Краснодарския регион (Таблици 4, 5).
Таблица 4. Откриване на Colletotrichum coccodes върху картофени клубени *
Номер на пробата | Картофено разнообразие | Място на растеж | В. откриване на кокодове | Прагов цикъл |
---|---|---|---|---|
1 | Червена алена | Костромска област | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Санте | Московска област | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Жуковски рано | Московска област | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | женствен мъж | Калуга област. | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | фантазия | Калуга област. | - | |
15 | гала | Нижни Новгород региона. | - | |
16 | - |
Забележка. * Количеството ДНК във всички проби е 50 ng.
Таблица 5. Откриване на Colletotrichum coccodes по листата на домати *
Номер на пробата | Място на растеж | В. откриване на кокодове | Прагов цикъл |
---|---|---|---|
1 | Краснодарска територия, Кримска област | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Краснодарска територия, област Йейск | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* Количеството ДНК във всички проби е 50 ng.
Създадената от нас система за изпитване не отстъпва на тази, разработена от британски изследователи (Cullen et al., 2002) по чувствителност и специфичност и е подходяща за анализ на растителни проби. Приложението му за анализ на семенни клубени даде възможност да се идентифицира ДНК на C. coccodes в грудки без външни признаци на увреждане и да се анализира успешно инфекцията на листата.
Към днешна дата в Русия не е извършван анализ на картофени клубени за заразяване с C. coccodes. Първото ни проучване показа, че от 16 тествани семенни клубена, отглеждани в различни региони на Руската федерация, 5 съдържат C. coccodes. Това показва, че черното петно по картофените клубени е често срещано картофено заболяване в Русия и ролята му за намаляване на обема и качеството на картофената реколта е подценена.
Анализът на листата от домати разкрива значително присъствие на ДНК на C. coccodes в един лист от район Йейск на Краснодарска територия. По-рано, при изследване на доматни полета в южна Русия с помощта на британската тестова система (Cullen et al., 2002), бяха открити листа, съдържащи C. coccodes, а в някои полета беше открит висок процент листа, заразени с C. coccodes (Belov et al., 2018). В Краснодарската и Приморската територия, Московска област, открихме доматени плодове, от които успяхме да изолираме чисти култури от C. coccodes. Възможно е C. coccodes да е много по-широко разпространен върху доматите в Русия, отколкото се смята сега, и неговата вредност също е подценена.
По този начин към днешна дата се е натрупала достатъчно информация за широкото разпространение на C. coccodes върху картофи и домати.
За да се разбере по-добре ролята на тази гъба в развитието на болести по картофите и доматите, е необходимо да се следи разпространението й в Русия, да се изследва ролята на почвените и семенните инфекции и ролята на черното петно в загубите по време на съхранението. Използването на PCR диагностика може значително да улесни тази работа и едновременното използване на двете тестови системи значително ще увеличи точността на анализа.
Тази работа беше подкрепена от гранта на Руската научна фондация № 18-76-00009.
Статията е публикувана в списание „Микология и фитопатология“ (том 54, No 1, 2020).