S.N. Елански, Л.Ю. Кокаева, Н.В. Statsyuk, Yu.T. Дяков
въведение
Oomycete Phytophthora infestans (Mont.) De Bary, причинителят на късната болест, най-важното икономически заболяване на картофите и доматите, привлича вниманието на изследователи от различни страни повече от век и половина. Внезапно се появява в Европа в средата на XNUMX век, причинява картофена епидемия, която остава в паметта на много поколения.
Досега често го наричат „гъбата на ирландския глад“. Почти сто години след първите епидемии са открити диви мексикански видове картофи, устойчиви на късна болест, са разработени методи за кръстосването им с култивирани картофи (Muller, 1935) и са получени първите устойчиви на късна болест сортове (Пушкарев, 1937). Въпреки това, скоро след началото на тяхното търговско отглеждане, се натрупват раси от патоген на късната болест, които са били вирулентни към устойчиви сортове. и въвеждането на нови гени на устойчивост от диви мексикански картофи в сортовете започна бързо да губи ефективност.
Неуспехите с използването на моногенна (вертикална) резистентност принудиха животновъдите да търсят по-сложни начини за използване на неспецифична полигенна (хоризонтална) резистентност. През последните години силно агресивни раси започнаха да се натрупват в отделни популации на паразита, причинявайки ерозия дори на неспецифична устойчивост. Появата на устойчиви на фунгициди щамове създава проблеми при използването на химикали за защита на картофите.
Поради значителните разлики между оомицетите и гъбите в химичния състав, ултраструктурата и метаболизма, фунгицидите, особено системните, използвани за защита на растенията от много гъбични заболявания, са неефективни срещу оомицетите.
Следователно при химическата защита срещу късна болест се използва многократно (до 12 пъти на сезон или повече) пръскане с контактни препарати с широк спектър на действие. Революционна стъпка беше използването на фениламиди, които са токсични за оомицетите и се разпространяват системно в растенията. Широкото им използване обаче бързо доведе до натрупване на устойчиви щамове в гъбични популации (Davidse et al., 1981), което значително усложни растителната защита. P. infestans е практически единственият паразит в умерения пояс, вредата от който в биологичното земеделие не може да бъде неутрализирана без използването на химически средства за защита (Van Bruggen, 1995).
Горното обяснява огромното внимание, отделено от изследователи от различни страни на изследването на популациите на P. infestans, динамиката на тяхното изобилие и генетичен състав, както и генетичните механизми на вариабилност.
Жизнен цикъл на R. INFESTANS
Oomycete Phytophthora infestans развива междуклетъчен мицел с хаустория в картофените листа. Хранейки се с тъканите на листата, той причинява образуването на тъмни петна, които почерняват и гният във влажно време. При силно поражение целият лист умира. След период на хранене, върху мицела се образуват израстъци - спорангиофори - които растат навън през устиците. При влажно време те образуват бял цвят около петна от долната страна на листата. В краищата на спорангиофорите се образуват зооспорангии с форма на лимон, които се отчупват и се носят чрез пръскане на дъжд (фиг. 1). Попадайки в капки вода на повърхността на картофени листа, спорангиите покълват с 6-8 зооспори, които след период на движение се закръгляват, покриват се с мембрана и покълват с зародишна тръба. Кълновете проникват през листната тъкан през устицата. При определени условия спорангиите могат да растат в тръба за растеж директно в листната тъкан. При благоприятни условия времето от инфекцията до образуването на ново спороношение е само 3-4 дни.
Веднъж попаднали на земята и филтрирани през почвата, спорангиите могат да заразят клубените. Силно засегнатите грудки загниват по време на съхранение; при слабо засегнатите инфекцията може да продължи до следващия сезон. В допълнение, причинителят на късната болест може да се запази през зимата под формата на ооспори (дебелостенни почиващи полови спори) в почвата върху растителни остатъци и върху семена от домати. Ооспорите се образуват върху живите растителни органи, когато щамове от различни видове чифтосване се срещат с прекомерна влага. През пролетта се образува безполова спороношение върху засадени заразени грудки и върху растителни остатъци с ооспори; зооспорите навлизат в почвата и причиняват инфекция на долните листа на растенията. В някои случаи мицелът може да расте от заразената грудка по зелената част на растението и обикновено се появява в горната част на стъблото.
Значителна разлика между оомицетите и повечето гъби се крие в преобладаването на диплофазата в техния жизнен цикъл с гаметична мейоза и покълване на зиготи (ооспори) без редуктивно ядрено делене. Тази характеристика, плюс диполярен хетеротализъм, заместващ бисексуалността, изглежда дава възможност да се приложат към оомицетите подходите, разработени за изучаване на популации от по-висши еукариоти (анализ на панмиксия и подразделяне на популациите, интра- и интерпопулационни генни потоци и др.). Три фактора обаче не позволяват напълно да се пренесат тези подходи при изследването на популациите на P. infestans.
1. Наред с хибридните ооспори в популациите се образуват самоплодни и партеногенетични ооспори (Fife and Shaw, 1992; Anikina et al., 1997a; Savenkova, Cherepnikoba-Anirina, 2002; Smirnov, 2003), като честотата на тяхното образуване може да бъде достатъчна, за да повлияе върху резултатите от теста.
2. Половият процес при P. infestans има незначителен принос за динамиката на размера на популацията, тъй като гъбата се размножава главно чрез вегетативни спори, образувайки за повече от 90% резултатите от анализа на типа на чифтосване по традиционния метод върху хранителна среда ... вегетационния период на няколко поколения безполови спороношения (развитие на полициклична болест). Ооспорите играят важна роля за запазването на организма през периода, когато няма зелени растения (през зимата) и за първичната инфекция на разсад. След това през лятото настъпва клоново размножаване и увеличаване или, обратно, намаляване на броя на отделните клонинги, възникващи в резултат на сексуална рекомбинация, което се определя главно от избора на по-адаптирани. Следователно съотношението на отделните клонинги в популация в началото и в края на епифитотиката може да бъде напълно различно.
3. Описаният цикъл е характерен за местните популации на P. infestans в родината им, Централна Америка. В други области на света сексуалният процес не е бил известен повече от 100 години; вегетативният мицел в заразените картофени клубени е бил фазата на зимуване. Жизненият цикъл беше напълно агамен и разпространението беше фокусно по своя характер: инфекцията от единично заразени засадени клубени премина към листата, образувайки първични огнища на болестта, които могат да се слеят по време на масовото развитие на болестта.
По този начин в някои региони може да има редуване на сексуален и безполов цикъл, докато в други - само безполов цикъл.
Произход на P. INFESTANS
P. infestans се появяват в Европа в края на първата половина на 1991 век. Тъй като картофът е роден в североизточната част на Южна Америка, се предполагаше, че паразитът е донесен от там в Европа по време на бума на чилийската селитра. Проучванията, проведени в картофената станция Рокфелер център в долината на Толука, Мексико, принудиха тази гледна точка да бъде преразгледана (Niederhauser, 1993, XNUMX).
1. В долината на Толука местните грудкови картофени видове (Solanum demissum, S. bulbocastanum и др.) Имат различни набори гени за вертикална устойчивост, съчетани с високо ниво на неспецифична устойчивост, което показва продължителна коеволюция с паразита. Южноамериканските видове, включително реколтата от картофи, нямат гени за устойчивост.
2. В долината на Толука има изолати с чифтосване типове А1 и А2, в резултат на което е широко разпространена кръстоската популация на P. infestans; докато в родината на култивирания картоф, Южна Америка, паразитът се разпространява клонално.
3. В долината на Толука има ежегодни тежки епидемии от късна болест. Следователно сред изследователите от Северна Америка (Университет Корнел) се установява мнението за Мезоамерика (Централна Америка) като родно място на картофената фитофтора (Goodwin et al., 1994).
Южноамериканските изследователи не споделят това мнение. Те вярват, че култивираният картоф и неговият паразит P. infestans имат обща родина - южноамериканските Анди. Те подкрепиха своята гледна точка чрез молекулярни изследвания за анализ на ДНК полиморфизми на митохондриалния геном (mtDNA) и ядрени гени RAS и β-тубулин (Gomez-Alpizar et al., 2007). Те показаха, че щамовете, събрани от различни части на света, произлизат от три разнопосочни родови линии, които (и трите) се намират в Южноамериканските Анди. Андийските хаплотипове са потомци на две линии: изолати от най-старата линия на mtDNA се срещат върху диви Solanaceae от секцията Anarrhicomenum в Еквадор, докато изолатите от втората линия са често срещани при картофите, доматите и дивите нощници. В Толука дори редки хаплотипове произлизат само от една линия, като генетичната променливост на щамовете Толука (ниска алелна честота на някои променливи места) показва силен ефект на основателя поради скорошния дрейф.
Освен това в Андите е открит нов вид P. andina, морфологично и генетично подобен на P. infestans, който според авторите посочва Андите като гореща точка на видообразуване в рода Phytophthora. И накрая, в Европа и Съединените щати популациите на P. infestans включват и двете андски линии, докато в Толука само една.
Тази публикация предизвика отговор от група изследователи от различни страни, които извършиха много експериментална работа, за да ревизират предишното проучване (Goss et al., 2014). В тази работа, първо, бяха използвани по-информативни микросателитни ДНК последователности за изследване на ДНК полиморфизми; второ, за анализ на клъстерирането, пътищата на миграция, времето на разминаване на популациите и др. бяха използвани по-усъвършенствани модели (F-статистика, байесови приближения и др.) и, на трето място, беше използвано сравнение не само с Андския вид P. andina, при който беше установена хибридна природа (P. infestans x Phytophthora sp.) но също така и с мексиканските ендемични видове P. mirabilis, P. Ipomoeae и Phytophthora phaseoli, които са генетично близки P. infestans, включени в същата клада (Kroon et al., 2012). В резултат на тези анализи беше недвусмислено показано, че кореновата част на филогенетичното дърво на всички видове от рода Phytophthora, взети в изследването, с изключение на хибрида P. andina, принадлежи към мексикански щамове и миграционният поток има посока Мексико - Анди, а не обратно, а началото му съвпада с европейското колонизация на Новия свят (преди 300-600 години). По този начин появата на вида P. infestans, специализиран за поражението на картофите, се е случила във вторичния генетичен център на образуването на грудкови нощници, т.е. в Централна Америка.
Геном на P. INFESTANS
През 2009 г. международен екип от учени секвенира пълния геном на P infestans (Haas et al, 2009), чийто размер беше 240 MB. Това е няколко пъти повече, отколкото при близкородните видове P. sojae (95 Mb), които причиняват гниене на корените на соята, и P. Ramorum (65 Mb), засягащи такива ценни дървесни видове като дъб, бук и някои други. Получените данни показват, че геномът съдържа голям брой копия на повтарящи се последователности - 74%. Геномът съдържа 17797 гени, кодиращи протеини, по-голямата част от които са гени, участващи в клетъчни процеси, включително репликация на ДНК, транскрипция и транслация на протеини.
Сравнението на геноми от рода Phytophthora разкри необичайна геномна организация, състояща се от блокове от последователности на консервирани гени, в които генната плътност е относително висока и съдържанието на повтарящи се последователности е сравнително ниска и отделни региони с неконсервирани генни последователности, с ниска генна плътност и високо съдържание на повтарящи се региони. Консервативните блокове представляват 70% (12440) от всички гени, кодиращи протеини на P. infestans. В рамките на консервативните блокове гените обикновено са разположени на близко разстояние със средно междугенно разстояние от 604 bp. В областите между консервативните блокове междугенното разстояние е по-голямо (3700 bp) поради увеличаване на плътността на повтарящите се елементи. Бързо развиващите се ефекторни секреторни гени се намират в бедни на гени региони.
Анализът на последователността на генома на P. Infestans показа, че приблизително една трета от генома принадлежи на транспонируеми елементи. Геномът на P. infestans съдържа значително повече различни семейства транспозони, отколкото други известни геноми. Повечето транспозони на P. infestans принадлежат към семейството на циганите.
В генома на P. infestans са идентифицирани голям брой специфични генни семейства, участващи в патогенезата. Значителна част от тях кодират ефекторни протеини, които променят физиологията на растението гостоприемник и допринасят за неговата инфекция. Те принадлежат към две широки категории: апопластични ефектори, които действат в междуклетъчните пространства (апопласти) и цитоплазмени ефектори, които навлизат в клетките чрез хаустория. Апопластичните ефектори включват секретирани хидролитични ензими като протеази, липази и гликозилази, които унищожават растителните клетки; инхибитори на ензими за защита на растенията гостоприемници и некротизиращи токсини като Nep1-подобни протеини (NPL) и Pcf-подобни малки богати на цистеин протеини (SCR).
Ефекторните гени на P. infestans са многобройни и обикновено са по-големи от непатогенните гени. Най-известни са цитоплазмените ефектори RXLR и Crinkler (CNR). Типичните цитоплазмени ефектори на оомицетите са RXLR протеини. Всички открити досега RXLR ефекторни гени съдържат амино-терминалната група Arg-XLeu-Arg, където X е аминокиселина. В резултат на проучването се предполага, че в генома на P. infestans има 563 RXLR гена, което е с 60% повече в сравнение с P. sojae и P. ramorum. Приблизително половината от RXLR гените в генома на P. infestans са специфични за видовете. RXLR ефекторите имат голямо разнообразие от последователности. Сред тях са идентифицирани едно голямо и 150 малки семейства. За разлика от основния протеом, RXLR ефекторните гени обикновено се намират в бедни на гени и богати на повторения региони на генома. Подвижните елементи, които определят динамичността на тези региони, улесняват рекомбинацията в тези гени.
Цитоплазмените CRN ефектори първоначално са идентифицирани в транскриптите на P. infestans, кодиращи пептиди, които индуцират некроза на растителната тъкан. От тяхното откритие малко се знае за семейството на тези ефектори. Анализът на генома на P. Infestans разкри огромно семейство от 196 гена CRN, което е много по-голямо от това на P. sojae (100 CRN) и P. ramorum (19 CRN). Подобно на RXLR, CRN са модулни протеини и се състоят от силно консервиран N-краен LFLAK домен (50 аминокиселини) и съседен DWL домен, съдържащ различни гени. Повечето CRN (60%) притежават сигнален пептид.
Изследвана е възможността на различни CRN да нарушат клетъчните процеси на растението гостоприемник. Когато се анализира некрозата на растенията, отстраняването на CRN2 протеини направи възможно идентифицирането на С-крайния регион, състоящ се от 234 аминокиселини (позиции 173-407, DXG домейн) и причиняващ клетъчна смърт. Анализът на CRN гените на P. infestans разкри четири различни С-терминални области, които също причиняват клетъчна смърт в растението. Те включват новоидентифицираните DC домейни (P. Infestans има 18 гена и 49 псевдогени), както и D2 (14 и 43) и DBF (2 и 1) домейни, които са подобни на протеинкиназите. Протеините на CRN домейни, експресирани в растение, се запазват (при липса на сигнални пептиди) в растителна клетка и стимулират клетъчната смърт чрез вътреклетъчен механизъм. Други 255 последователности, съдържащи CRN домейни, най-вероятно не функционират като гени.
Увеличението на броя и размера на RXLR и CRN ефекторните генни семейства се дължи на неалелна хомоложна рекомбинация и дублиране на гени. Въпреки факта, че геномът съдържа голям брой активни подвижни елементи, все още няма преки доказателства за трансфера на ефекторни гени.
Методи, използвани при изследване на структурата на популацията
Понастоящем изследването на генетичната структура на популациите се основава на анализ на чисти култури от съставните му щамове. Анализът на популациите без изолиране на чисти култури също се извършва с конкретни цели, като например изследване на агресивността на популация или наличие на щамове, устойчиви на фунгициди в нея (Filippov et al., 2004; Derevyagina et al., 1999). Този тип изследвания включва използването на специални методи, чието описание е извън обхвата на този преглед. За сравнителния анализ на щамовете се използват редица методи, основаващи се както на анализа на структурата на ДНК, така и на изследването на фенотипни прояви. Сравнителният анализ на популациите трябва да се справи с голям брой изолати, което налага определени изисквания към използваните методи. В идеалния случай те трябва да отговарят на следните изисквания (Cooke, Lees, 2004, Mueller, Wolfenbarger, 1999):
- да бъдат евтини, лесни за изпълнение, да не изискват значителни времеви разходи, да се основават на общодостъпни технологии (например PCR);
- трябва да генерира достатъчно голям брой независими кодоминантни маркери;
- имат висока възпроизводимост;
- използвайте минималното количество тъкан за изследване;
- да бъдат специфични за субстрата (замърсяването, присъстващо в културата, не трябва да влияе върху резултатите);
- не изискват използването на опасни процедури и силно токсични химикали.
За съжаление няма методи, отговарящи на всички горепосочени параметри. За сравнително изследване на щамове в наше време се използват методи, базирани на анализ на фенотипни белези: вирулентност към сортовете картофи и домати (картофи и домати), тип чифтосване, спектри на пептидазни изоензими и глюкозо-6-фосфатна изомераза и на анализ на структурата на ДНК: полиморфизъм на дължината рестрикционен фрагмент (RFLP), който обикновено се допълва с хибридизационна сонда RG 57, анализ на микросателитни повторения (SSR и InterSSR), усилване с произволни праймери (RAPD), усилване на рестрикционни фрагменти (AFLP), усилване с праймери, хомологични на последователности от подвижни елементи (например Inter SINE PCR), определяне на митохондриални ДНК хаплотипове.
Кратко описание на методи за сравнително изследване на щамове, използвани в работата с P. Infestans
Фенотипни белези на маркера
"Картофени" състезания
„Картофените“ раси са често изследван и използван маркер. „Простите картофени“ раси имат един ген за вирулентност на картофите, „сложните“ - поне два. Black et al. (1953), обобщавайки всички данни, с които разполагат, установяват, че расата на фитофтора е способна да зарази растенията с резистентния ген / гени, съответстващи на гена / гените на вирулентност на P. infestans, и откри раси 1, 2, 3 и 4, които заразяват растенията с гени R1, R2, R3 и R4, съответно, т.е. взаимодействието между паразита и гостоприемника се осъществява в съответствие с генния принцип. Освен това Блек, с участието на Gallegly и Malcolmson, открива гените на резистентност R5, R6, R7, R8, R9, R10 и R11, както и съответните раси (Black, 1954; Black & Gallegly, 1957; Malcolmson & Black, 1966; Malcolmson, 1970).
Съществуват обширни данни за расовия състав на патогена от различни региони. Без да анализираме тези данни в детайли, ще посочим само обща тенденция: където са използвани сортове с нови гени на резистентност или техните комбинации, първоначално е имало известно отслабване на късната болест, но след това са се появили раси със съответните гени на вирулентност и са били възобновени огнищата на късна болест. Рядко се наблюдава специфична вирулентност срещу първите 4 резистентни гена (R1-R4) в колекциите, събрани преди въвеждането в отглеждането на сортове с тези гени, но броят на вирулентните щамове се увеличава рязко, когато патогенът паразитира върху сортове, носещи тези гени. От друга страна, гени 5-11 бяха доста разпространени в колекциите (Shaw, 1991).
Изследване на съотношението на различните раси през вегетационния период, проведено в края на 1980-те години, показа, че в началото на развитието на болестта в популацията преобладават клонинги с ниска агресивност и 1-2 вирулентни гени.
Освен това, с развитието на късна болест, концентрацията на оригиналните клонинги намалява и броят на "сложните" раси с висока агресивност се увеличава. Появата на последните до края на сезона достига 100%. При съхранение на грудки се наблюдава намаляване на агресивността и загуба на отделни вирулентни гени. Динамиката на заместването на клонинги може да се прояви при различни сортове по различни начини (Rybakova & Dyakov, 1990). Нашите проучвания през 2000-2010 г. обаче показват, че от самото начало на епифитотията се срещат сложни раси сред щамове, изолирани както от картофи, така и от домати. Това вероятно се дължи на промяна в популациите на P. Infestans в Русия.
Към 1988-1995 г. честотата на поява на "суперраси" с всички или почти всички гени на вирулентност в различни региони достига 70-100%. Тази ситуация беше отбелязана например в Беларус, в Ленинградска и Московска област, в Северна Осетия и в Германия (Ivanyuk et al., 2002a, 2002b; Polityko, 1994; Schober-Butin et al., 1995).
Състезания "Домат"
В сортовете домати са открити само 2 гена на устойчивост на късна болест - Ph1 (Gallegly & Marvell, 1955) и Ph2 (Al-Kherb, 1988). Както в случая с картофените състезания, взаимодействието между доматите и P. infestans се осъществява на база ген по ген. Т0 расата заразява сортове, които нямат гени на резистентност (повечето индустриално използвани сортове), расата Т1 заразява сортове с ген Ph1 (Отава), а расата T2 заразява сортове с ген Ph2.
В Русия почти изключително T0 е открит върху картофите; T0 преобладаваше върху доматите в началото на сезона, но по-късно той беше заменен от расата T1 (Dyakov et al., 1975, 1994). След 2000 г. Т1 върху картофи в много популации започва да се появява в самото начало на епифитотиците. В Съединените щати картофените щамове са непатогенни за доматите, както и расите Т0, Т1 и Т2, докато Т1 и Т2 преобладават върху доматите (Vartanian & Endo, 1985; Goodwin et al., 1995).
Тип чифтосване
За изследването са необходими тестови (референтни) щамове с известни типове чифтосване - А1 и А2. Тестовият изолат се инокулира с тях по двойки в чашки на Петри със среда от овесен агар. След инкубация в продължение на 10 дни плочите се изследват за наличие или отсъствие на ооспори в средата в контактната зона на щамовете. Има 4 опции: щамът принадлежи към тип чифтосване А1, ако образува ооспори с тестер А2, до А2, ако образува ооспори с тестер А1, до А1А2, ако образува ооспори и с двата тестера, или е стерилен (00), ако не образува ооспори без тестер (последните две групи са редки).
За по-бързо определяне на видовете чифтосване бяха направени опити за идентифициране на региони на генома, свързани с вида на чифтосването, с цел по-нататъшното им използване за определяне на вида на чифтосване чрез PCR. Един от първите успешни експерименти за идентифициране на такъв сайт е проведен от американски изследователи (Judelson et al., 1995). Използвайки метода RAPD, те успяха да идентифицират региона W16, свързан с типа на чифтосване в потомството на два кръстосани изолата, и проектираха чифт 24-bp праймери за неговото усилване (W16-1 (5'-AACACGCACAAGGCATATAAATGTA-3 ') и W16-2 (5' -GCGTAATGTAGCGTAACAGCTCTC-3 ') След ограничаване на PCR продукта с рестрикционния ензим HaeIII, беше възможно да се разделят изолатите с двойки тип А1 и А2.
Друг опит за получаване на PCR маркери за определяне на видовете чифтосване е предприет от корейски изследователи (Kim, Lee, 2002). Те идентифицираха специфични продукти, използвайки метода AFLP. В резултат на това бяха разработени чифт праймери PHYB-1 (напред) (5'-GATCGGATTAGTCAGACGAG-3 ') и PHYB-2 (5'-GCGTCTGCAAGGCGCATTTT-3'), позволяващи селективно усилване на геномната област, свързана с A2 чифтосване. Впоследствие те продължиха тази работа и проектираха праймери 5 'AAGCTATACTGGGACAGGGT-3' (INF-1, напред) и 5'-GCGTTCTTTCGTATTACCAC-3 '(INF-2), позволявайки селективно усилване на Mat-A1 областта, характерна за щамове с тип чифтосване А1. Използването на PCR диагностика на типове чифтосване показа добри резултати при изследването на популациите на P. infestans в Чешката република (Mazakova et al., 2006), Тунис (Jmour, Hamada, 2006) и други региони. В нашата лаборатория (Mytsa, Elansky, непубликувана) бяха анализирани 34 щама на P. infestans, изолирани от болни органи от картофи и домати в различни региони на Русия (Кострома, Рязан, Астрахан, Московска област). Резултатите от PCR анализ с използване на специфични праймери повече от 90% съвпадат с резултатите от анализа на типа чифтосване по традиционния метод върху хранителна среда.
Таблица 1. Променливост на резистентността в клона Sib 1 (Elansky et al., 2001)
Място за събиране на проби | Брой анализирани изолати | Брой чувствителни (S), слабо устойчиви (SR) и устойчиви (R) щамове, бр (%) | ||
S | SR | R | ||
Владивосток | 10 | 1 (10) | 4 (40) | 5 (50) |
Г. Чита | 5 | 0 | 0 | 5 (100) |
Иркутск | 9 | 9 (100) | 0 | 0 |
Красноярск | 13 | 12 (92) | 1 (8) | 0 |
Град Екатеринбург | 15 | 8 (53) | 1 (7) | 6 (40) |
О. Сахалин | 66 | 0 | 0 | 66 (100) |
Омска област | 18 | 0 | 0 | 18 (100) |
Резистентност към металаксил като популационен маркер
В началото на 1980-те години в различни региони се забелязват мощни огнища на късна болест, причинени от устойчиви на металаксил щамове на P. infestans. Картофените ферми в много страни са претърпели значителни загуби (Dowley & O'Sullivan, 1981; Davidse et al., 1983; Derevyagina, 1991). Оттогава в много страни по света се провежда постоянно наблюдение на появата на резистентни на фениламид щамове в популациите на P. infestans. В допълнение към практическата оценка на перспективите за употребата на фениламид-съдържащи лекарства, изграждането на система от защитни мерки и прогнозирането на епифитотии, резистентността към тези лекарства се превърна в един от маркерите, широко използвани за сравнителен анализ на популации от този патоген. Използването на резистентност към металаксил обаче в сравнителни популационни проучвания трябва да се извърши, като се вземе предвид факта, че: 1 - генетичната основа на резистентност все още не е точно определена, 2 - резистентността към металаксил е селективно зависима черта, която може да се промени в зависимост от употребата на фениламиди, 3 - различна степента на чувствителност към металаксилни щамове в рамките на една клонална линия (таблица. 1).
Спектри на изоензими
Изозимните маркери обикновено са независими от външните условия, показват Менделево наследство и са кодоминантни, което позволява да се прави разлика между хомо- и хетерозиготи. Използването на протеини като генни маркери дава възможност да се идентифицират както големи реорганизации на генетичния материал, включително хромозомни и геномни мутации, така и единични аминокиселинни замествания.
Електрофоретичните изследвания на протеини показват, че повечето ензими съществуват в организмите под формата на няколко фракции, различаващи се по електрофоретична подвижност. Тези фракции са резултат от кодиране на множество форми на ензими от различни локуси (изоцими или изозими) или от различни алели на един и същ локус (алозими или алоензими). Тоест, изозимите са различни форми на един ензим. Различните форми имат една и съща каталитична активност, но леко се различават по замествания на единични аминокиселини в пептида и в заряда. Такива разлики се разкриват по време на електрофореза.
При изследване на щамовете на P. infestans се използват спектрите на изоензимите на два протеина, пептидаза и глюкозо-6-фосфатна изомераза (този ензим е мономорфен в руските популации, поради което в тази работа не са представени методи за неговото изследване). За да се разделят на изоцими в електрическо поле, протеинови препарати, изолирани от изследваните организми, се нанасят върху гелова плака, поставена в електрическо поле. Скоростта на дифузия на отделни протеини в гела зависи от заряда и молекулното тегло; следователно в електрическо поле сместа от протеини се разделя на отделни фракции, които могат да бъдат визуализирани с помощта на специални багрила.
Изследването на пептидазните изоензими се извършва върху целулозни ацетатни, нишестени или полиакриламидни гелове. Най-удобен е методът, основан на използването на целулозни ацетатни гелове, произведени от Helena Laboratories Inc. Той не изисква големи количества тестови материали, той позволява да се получат контрастни ленти върху гела след електрофореза и за двата ензимни локуса, неговото изпълнение не изисква големи времеви и материални разходи (фиг. 2).
Малко парче мицел се прехвърля в микротръба от 1,5 ml, към него се добавят 1-2 капки дестилирана вода. След това пробата се хомогенизира (например с електрическа бормашина с пластмасова приставка, подходяща за микротръба) и се утаява за 25 секунди на центрофуга при 13000 об / мин. 8 μl от всяка микротръба. супернатантата се прехвърля върху плочата на апликатора.
Целулозният ацетатен гел се отстранява от буферния контейнер, попива се между два листа филтърна хартия и се поставя с работния слой върху пластмасовата основа на апликатора. Разтворът от плаката се прехвърля от апликатора върху гела 2-4 пъти. Гелът се прехвърля в камера за електрофореза,
Таблица 2. Съставът на разтвора, използван за оцветяване на целулозен ацетатен гел при анализа на пептидазни изоензими, капка боя (бромофенолно синьо) се поставя върху ръба на гела.
TRIS HCl, 0,05 М, Ph 8,0 2 ml
Пероксидаза, 1000 U / ml 5 капки
о-дианизидин, 4 mg / ml 8 капки
MgCl2, 20 mg / ml 2 капки
Gly-Leu, 15 mg / ml 10 капки
L-аминокиселинна оксидаза, 20 u / ml 2 капки
Електрофорезата се извършва в продължение на 20 минути. при 200 V. След електрофореза гелът се прехвърля върху маса за боядисване и се боядисва със специален разтвор за боядисване (Таблица 2). 10 ml 1,6% DIFCO агар предварително се разтопяват в микровълнова фурна, охлаждат се до 60 ° C, след което 2 ml агар се смесват с бойна смес и се изсипват върху гела. Ивици се появяват в рамките на 15-20 минути. L-аминокиселинният оксидазен реагент се добавя непосредствено преди смесването на разтвора с разтопен агар.
В руските популации локусът Pep 1 е представен от генотипове 100/100 и 92/100. Homozygote 92/92 е изключително рядък (около 0,1%). Locus Rehr 2 е представен от три генотипа 100/100, 100/112 и 112/112, като и трите варианта са доста често срещани (Elanky and Smirnov, 3, Фиг. 2003).
Изследване на генома
Полиморфизъм с дължина на рестрикционния фрагмент с последваща хибридизация (RFLP-RG 57)
Общата ДНК се третира с рестрикционен ензим Eco R1, ДНК фрагментите се разделят чрез електрофореза в агарозен гел. Ядрената ДНК е много голяма и има много повтарящи се последователности, което затруднява директния анализ на многобройните фрагменти, получени от действието на рестрикционните ензими. Следователно, ДНК фрагментите, отделени в гела, се прехвърлят в специална мембрана и се използват за хибридизация със сондата RG 57, която включва нуклеотиди, маркирани с радиоактивни или флуоресцентни етикети. Тази сонда хибридизира с повтарящи се геномни последователности (Goodwin et al., 1992, Forbes et al., 1998). След визуализация на резултатите от хибридизацията върху лек или радиоактивен материал се получава мулти-локусен хибридизационен профил (пръстови отпечатъци), представен от 25-29 фрагмента (Forbes et al., 1998). Безполовите (клонални) потомци ще имат същите профили. По подреждането на лентите на електрофоретограмата може да се прецени сходствата и разликите на сравняваните организми.
Митохондриални ДНК хаплотипове
В повечето еукариотни клетки mtDNA се представя под формата на двуверижна кръгова ДНК молекула, която за разлика от ядрените хромозоми на еукариотните клетки се репликира полуконсервативно и не е свързана с протеинови молекули.
Митохондриалният геном на P. infestans беше секвениран и редица трудове бяха посветени на анализа на дължините на рестрикционни фрагменти (Carter et al, 1990, Goodwin, 1991, Gavino, Fry, 2002). След като Griffith and Shaw (1998) разработват прост и бърз метод за определяне на mtDNA хаплотипове, този маркер се превръща в един от най-популярните в изследванията на P. Infestans, Същността на метода се състои в последователно усилване на два митохондриални ДНК фрагмента (от общия геном) с праймери F2-R2 и F4-R4 (Таблица 3) и последващото им ограничаване с рестрикционни ензими MspI (1-ви фрагмент) и EcoR1 (2-ри фрагмент). Методът ви позволява да идентифицирате 4 хаплотипа: Ia, IIa, Ib, IIb. Тип II се различава от тип I по наличието на вложка от 1881 bp и различно местоположение на местата за ограничение в регионите P2 и P4 (фиг. 3).
От 1996 г. сред щамовете, събрани на територията на Русия, са отбелязани само хаплотипове Ia и IIa (Elansky et al., 2001, 2015). Те могат да бъдат идентифицирани след разделяне на рестрикционните продукти с праймера F2-R2 в електрическо поле (фиг. 4, 5). Видовете mtDNA се използват при сравнителен анализ на щамове и популации. В редица проучвания са използвани видове митохондриална ДНК за изолиране на клонални линии и паспортизиране на изолатите на P. infestans (Botez et al., 2007; Shein et al., 2009). Използвайки метода PCR-RFLP, беше направено заключението, че mtDNA е хетерогенна в същия щам P. infestans (Elansky and Milyutina, 2007). Условия на усилване: 1x (500 сек. 94 ° C), 40x (30 сек. 90 ° C, 30 сек. 52 ° C, 90 сек. 72 ° C); 1x (5 мин. 72 ° С). Реакционна смес: (20 μl): 0,2 U Taq ДНК полимераза, 1x 2,5 mM MgCl2-Taq буфер, 0,2 mM всеки dNTP, 30 pM праймер и 5 ng от анализираната ДНК, дейонизирана вода - до 20 μl.
Ограничаването на PCR продукта се извършва в продължение на 4-6 часа при температура 37 ° С. Рестрикционна смес (20 μl): 10x MspI (2 μl), 10x рестрикционен буфер (2 μl), дейонизирана вода (6 μl), PCR продукт (10 μl).
Таблица 3. Праймери, използвани за амплификация на mtDNA полиморфни области
Локус | грунд | Дължина и разположение на грунда | Дължина на PCR продукта | Рестрикционен ензим |
---|---|---|---|---|
P2 | F2: 5'- TTCCCTTTGTCCTCTACCGAT | 21 г.; 13619-13639 | 1070 | MspI |
R2: 5'- TTACGGCGGTTTAGCACATACA | 22 г.; 14688-14667 | |||
P4 | F4: 5'- TGGTCATCCAGAGGTTTATGTT | 22 г.; 9329-9350 | 964 | EcoRI |
R4:5 - CCGATACCGATACCAGCACCAA | 22 г.; 10292-10271 |
Случайно усилване на праймера (RAPD)
Когато се извършва RAPD, се използва един праймер (понякога няколко праймера едновременно) с произволна нуклеотидна последователност, обикновено с дължина 10 нуклеотида, с високо съдържание (от 50%) GC нуклеотиди и ниска температура на отгряване (около 35 ° C). Такива праймери "кацат" на множество допълващи се места в генома. След усилване се получават голям брой ампликони. Техният брой зависи от използвания (ите) праймер (и) и условията на реакцията (концентрация на MgCl2 и температура на отгряване).
Визуализацията на ампликони се извършва чрез дестилация в полиакриламид или агарозен гел. При извършване на RAPD анализ е необходимо внимателно да се следи чистотата на анализирания материал, тъй като замърсяването с други живи обекти може да причини значително увеличаване на броя на артефактите, които са доста многобройни при анализа на чист материал (Perez et al, 1998). Използването на този метод при изследването на генома на P. infestans е отразено в много трудове (Judelson, Roberts, 1999, Ghimire et al., 2002, Carlisle et al., 2001). Изборът на реакционни условия и праймери (проучени са 51 праймера с 10 нуклеотида) са дадени в статията от Abu-El Samen et al., (2003).
Микросателитен повторен анализ (SSR)
Микросателитните повторения (прости последователни повторения, SSR) са тандемно повтарящи се кратки последователности от 1-3 (понякога до 6) нуклеотиди, присъстващи в ядрените геноми на всички еукариоти. Броят на последователните повторения може да варира от 10 до 100. Микросателитните локуси се срещат с доста висока честота и са повече или по-малко равномерно разпределени в целия геном (Lagercrantz et al., 1993). Полиморфизмът на микросателитните последователности е свързан с разликите в броя повторения на основния мотив. Микросателитните маркери са кодоминиращи, което прави възможно използването им за анализ на структурата на популацията, определяне на родство, пътища на миграция на генотипа и др. Сред другите предимства на тези маркери трябва да се отбележи техният висок полиморфизъм, добра възпроизводимост, неутралност и способност за извършване на автоматичен анализ и оценка.Анализът на полиморфизма на микросателитните повторения се извършва чрез PCR усилване, използвайки праймери, допълващи уникални последователности, фланкиращи микросателитни локуси. Първоначално анализът се извършва с разделяне на реакционните продукти върху полиакриламиден гел. По-късно служителите на компанията Applied Biosystems предложиха да се използват флуоресцентно маркирани праймери с откриване на реакционни продукти с помощта на автоматичен лазерен детектор (Diehl et al., 1990), а след това и стандартни автоматични ДНК секвенсери (Ziegle et al., 1992). Етикетирането на праймери с различни флуоресцентни багрила дава възможност да се анализират няколко маркера наведнъж на една лента и съответно значително да се увеличи производителността на метода и да се увеличи точността на анализа.
Първите публикации, посветени на използването на SSR анализ за изследване на P. infestans, се появяват в началото на 2000-те. (Кнапова, Гиси, 2002). Не всички маркери, предложени от авторите, показват достатъчна степен на полиморфизъм, но два от тях (4B и G11) са включени в набора от 12 SSR маркера, предложени от Lees et al. (2006) и впоследствие приети в изследователската мрежа на Eucablight (www.eucablight .org) като стандарт за P. infestans. Няколко години по-късно е публикувано проучване за създаването на система за мултиплекс анализ на ДНК на P. infestans, базирана на осем SSR маркера (Li et al., 2010). И накрая, след оценка на всички предложени по-рано маркери и избор на най-информативния от тях, както и оптимизиране на праймери, флуоресцентни етикети и условия на усилване, същата група автори представи система за едноетапен мултиплекс анализ, включително 12 маркера (Таблица 4; Li et al. , 2013а). Праймерите, използвани в тази система, бяха избрани и етикетирани с един от четирите флуоресцентни маркера (FAM, VIC, NED, PET), така че диапазоните на размерите на алелите на праймерите със същите етикети не се припокриват.
Авторите извършиха анализа върху усилвател PTC200 (MJ Research, САЩ), използвайки QIAGEN мултиплекс PCR комплекти или QIAGEN Typeit Microsatellite PCR комплекти. Обемът на реакционната смес е 12.5 μL. Условията на амплификация бяха както следва: за QIAGEN мултиплекс PCR: 95 ° C (15 минути), 30x (95 ° C (20 секунди), 58 ° C (90 секунди), 72 ° C (60 секунди), 72 ° C (20 минути); за QIAGEN Type-it Microsatellite PCR: 95 ° C (5 минути), 28x (95 ° C (30 секунди), 58 ° C (90 секунди), 72 ° C (20 секунди), 60 ° C (30 минути).
Разделянето и визуализацията на PCR продукти се извършва с помощта на автоматичен капилярен ДНК анализатор ABI3730 (Applied Biosystems).
Таблица 4. Характеристики на 12 стандартни SSR маркера, използвани за генотипиране на P. Infestans (Li et al., 2013a)
Име | Брой алели | Диапазон на размера алели (bp) | Грундове |
PiG11 | 13 | 130-180 | F: NED-TGCTATTTATCAAGCGTGGG R: GTTTCAATCTGCAGCCGTAAGA |
ft02 | 4 | 255-275 | F: NED-ACTTGCAGAACTACCGCCC R: GTTTGACCACTTTCCTCGGTTC |
PinfSSR11 | 4 | 325-360 | F: NED-TTAAGCCACGACATGAGCTG R: GTTTAGACAATTGTTTTGTGGTCGC |
D13 | 16 | 100-185 | F: FAM-TGCCCCCTGCTCACTC R: GCTCGAATTCATTTTACACACTTG |
PinfSSR8 | 4 | 250-275 | FAM-AATCTGATCGCAACTGAGGG R: GTTTACAAGATACACACGTCGCTCC |
PinfSSR4 | 7 | 280-305 | FAM-TCTTGTTCGAGTATGGCGACG R: GTTTCACTTCGGGAGAAAGGCTTC |
ft04 | 4 | 160-175 | F: VIC-AGCGGCTTTACCGATGG R: GTTTCAGCGGCTGTTTCGAC |
ft70 | 3 | 185-205 | F: VIC-ATGAAAATACGTCAATGCTCG R: CGTTGGATATTTCTATTTCTTCG |
PinfSSR6 | 3 | 230-250 | F: GTTTTGGTGGGGCTGAAGTTTT R: VIC-TCGCCACAAGATTTATTCCG |
ft63 | 3 | 265-280 | F: VIC-ATGACGAAGATGAAAGTGAGG R: CGTATTTCCTGTTTATCTAACACC |
PinfSSR2 | 3 | 165-180 | F: PET-CGACTTCTACATCAACCGGC R: GTTTGCTTGGACTGCGTCTTTAGAG |
Pi4B | 5 | 200-295 | F: PET-AAAATAAAGCCTTTGGTTCA R: GCAAGCGAGGTTTGTAGATT |
Пример за визуализиране на резултатите от анализа е показан на фиг. 6. Резултатите бяха анализирани с помощта на софтуера GeneMapper 3.7 чрез сравняване на получените данни с данните на известни изолати. За да се улесни интерпретацията на резултатите от анализа, е необходимо във всяко проучване да се включат 1-2 референтни изолата с известен генотип.
Предложеният метод за изследване е тестван върху значителен брой полеви проби, след което авторите извършват стандартизация на протоколи между лаборатории на две организации, The James Hutton Institute (Великобритания) и Wageningen University & Research (Холандия), които, заедно с възможността за използване на стандартни FTA карти за опростени събирането и изпращането на проби от ДНК на P. infestans ни позволи да говорим за възможността за търговска употреба на тази разработка. В допълнение, бърз и точен метод за генотипиране на изолатите на P. infestans, използвайки мултиплекс SSR анализ, направи възможно провеждането на стандартизирани проучвания на популации от този патоген в глобален мащаб и създаването на световна база данни за късната болест в рамките на проекта Eucablight (www.eucablight.org), включително , включително резултатите от микросателитния анализ, направи възможно проследяването на появата и разпространението на нови генотипове по света.
Полиморфизъм с дължина на усилен рестрикционен фрагмент (AFLP). AFLP (усилен полиморфизъм с дължина на фрагмента) е технология за генериране на произволни молекулярни маркери, използвайки специфични праймери. При AFLP ДНК се третира с комбинация от два рестрикционни ензима. Специфични адаптери се свързват към лепкавите краища на ограничителните фрагменти.
След това тези фрагменти се амплифицират с помощта на праймери, допълващи последователността на адаптора и мястото на рестрикция и допълнително носещи една или повече произволни бази в техните 3 'краища. Наборът от получени фрагменти зависи от рестрикционни ензими и произволно избрани нуклеотиди в 3'-краищата на праймерите (Vos et al., 1995). AFLP - генотипизирането се използва за бързо изследване на генетичните вариации на различни организми.
Подробно описание на метода е дадено в трудовете на Mueller, Wolfenbarger, 1999, Savelkoul et al., 1999. Много работа, сравняваща разделителната способност на AFLP и SSR методите, е извършена от китайски изследователи. Изследвани са фенотипните и генотипните характеристики на 48 изолата P. infestans, събрани в пет региона на Северен Китай. AFLP спектрите разкриват осем различни ДНК генотипа, за разлика от SSR генотиповете, за които не е открито разнообразие (Guo et al., 2008).
Усилване с праймери, хомоложни на последователностите на подвижните елементи
Маркерите, получени от последователностите на ретротранспозоните, са много удобни за генетично картографиране, изследване на генетичното разнообразие и еволюционни процеси (Schulman, 2006). Ако праймерите са направени, за да допълнят стабилните последователности на определени подвижни елементи, е възможно да се усилят геномните области, разположени между тях. При проучвания на причинителя на късна болест успешно се използва методът за усилване на зоните на генома с помощта на праймер, допълващ основната последователност на SINE (Short Interspersed Nuclear Elements) ретроазон (Lavrova and Elansky, 2003). Използвайки този метод, бяха разкрити разлики дори в безполовото потомство на един изолат. В тази връзка беше направено заключението, че методът между SINE - PCR е изключително специфичен и скоростта на движение на SINE елементи в генома на Phytophthora е висока.
В генома на P. infestans са идентифицирани 12 семейства къси ретротранспозони (SINE); беше изследвано видовото разпространение на къси ретротранспозони, бяха идентифицирани елементи (SINE), които се намират в генома само на P. infestans (Lavrova, 2004).
Особености на приложението на методи за сравнително изследване на щамове в популационни изследвания
Когато планирате проучване, трябва ясно да разберете целите, които то преследва, и да използвате подходящите методи. По този начин някои методи правят възможно генерирането на голям брой независими маркери, но в същото време имат ниска възпроизводимост и силно зависят от използваните реагенти, условията на реакцията и замърсяването на тествания материал. Следователно при всяко изследване на група щамове е необходимо да се използват няколко стандартни (референтни) изолати, но дори и в този случай резултатите от няколко експеримента са много трудни за комбиниране.
Тази група методи включва RAPD, AFLP, InterSSR, InterSINE PCR. След амплификация се получават голям брой ДНК фрагменти с различни размери. Препоръчително е да се използват такива техники, ако е необходимо да се установят разлики между тясно свързани щамове (родители-потомци, диви мутанти и др.), Или в случаите, когато се изисква подробен анализ на малка проба. По този начин методът AFLP се използва широко при генетично картографиране на P. infestans (van der Lee et al., 1997) и при интрапопулационни изследвания (Knapova, Gisi, 2002, Cooke et al, 2003, Flier et al, 2003). Такива методи са неподходящи за използване при създаване на бази данни на щамове, тъй като практически е невъзможно да се унифицира отчитането на резултатите при извършване на анализи в различни лаборатории.
Въпреки привидната простота и бързина на изпълнение (изолиране на ДНК без добро пречистване, усилване, визуализация на резултатите), тази група методи изисква използването на специален метод за документиране на резултатите: дестилация в полиакриламиден гел с маркирани (радиоактивни или луминесцентни) праймери и последващо осветяване на светлина или радиоактивен материал. Конвенционалното изобразяване на етидиев бромид агарозен гел обикновено не е подходящо за тези методи, тъй като голям брой ДНК фрагменти с различни размери могат да се слеят.
Други методи, напротив, дават възможност за генериране на малък брой характеристики с тяхната много висока възпроизводимост. Тази група включва изследване на митохондриални ДНК хаплотипове (в Русия са отбелязани само два хаплотипа Ia и IIa), тип чифтосване (повечето изолати са подразделени на 2 типа: A1 и A2, самоплодни SF се срещат рядко) и пептидазни изозимни спектри (два локуса Pep1 и Pep2 , състоящ се от два изозима всеки) и глюкозо-6-фосфатна изомераза (в Русия няма променливост за тази черта, въпреки че се забелязва значителен полиморфизъм в други страни по света). Препоръчително е да използвате тези функции при анализ на колекции, съставяне на регионални и глобални бази данни. В случай на анализ на изозими и хаплотипове на митохондриална ДНК изобщо е възможно да се направи без стандартни щамове, докато при анализа на типове чифтосване са необходими два тестови изолата с известни типове чифтосване.
Условията на реакцията и реагентите могат да повлияят само на контраста на продукта върху електрофоретограмата; проявата на артефакти в тези видове изследвания е малко вероятно.
В момента по-голямата част от популациите в европейската част на Русия са представени от щамове от двата вида чифтосване (Таблица 6), сред които има изолати с типове Ia и IIa на митохондриална ДНК (други видове mtDNA, открити в света, не са открити в Русия след 1993 г.). Спектрите на пептидазните изозими са представени от два генотипа в локуса Pep1 (100/100, 92/92 и хетерозигота 92/100, а генотипът 92/92 е изключително рядък (<0,3%)) и от два генотипа в локуса Pep 2 (100/100 , 112/112 и хетерозигота 100/112, като генотипът 112/112 се среща по-рядко от 100/100, но и доста често).
Не е имало променливост в спектъра на изозимите на глюкозо-6-фосфатна изомераза след 1993 г. (изчезването на клоналната линия US-1); всички изследвани изолати са имали генотипа 100/100 (Elansky and Smirnov, 2002).
Третата група методи позволява да се получи достатъчна група от независими характеристики на маркер с висока възпроизводимост. Днес тази група включва сондата RFLP-RG57, която произвежда 25-29 ДНК фрагменти с различни размери. RFLP-RG57 може да се използва както при анализ на проби, така и при съставяне на бази данни. Този метод обаче е много по-скъп от предишните, отнема време и изисква достатъчно голямо количество силно пречистена ДНК. Следователно изследователят е принуден да ограничи обема на тествания материал.
Развитието на RFLP-RG57 в началото на 90-те години на миналия век значително засили изследванията на популацията на причинителя на късна болест. Той се превърна в основата на метода, основан на подбора и анализа на "клонални линии" (виж по-долу). Заедно с RFLP-RG57, тип чифтосване, ДНК пръстови отпечатъци (метод RFLP-RG57), спектри на изоензими на пептидаза и глюкозо-6-фосфатна изомераза и тип митохондриална ДНК се използват за идентифициране на клонални линии. Благодарение на него беше показано al., 1994), замяната на стари популации с нови (Drenth et al, 1993, Sujkowski et al, 1994, Goodwin et al, 1995a), разкри клонални линии, преобладаващи в много страни по света. Изследванията на руски щамове, използващи този метод, показват висок генотипичен полиморфизъм на щамовете от европейската част и мономорфизъм на популациите в азиатските и далекоизточните части на Русия (Elansky et al, 2001). И сега този метод остава основният в популационните изследвания на P. infestans. Широкото му разпространение обаче е възпрепятствано от доста високите разходи и трудоемкост при изпълнение.
Друга обещаваща техника, която рядко се използва при проучвания на P. infestans, е анализ на микросателитно повторение (SSR). В момента този метод се използва широко за изолиране на клонални линии. За анализа на щамовете са широко използвани (и продължават да се използват) такива фенотипни маркери, като наличието на гени на вирулентност към сортовете картофи (Avdey, 1995, Ivanyuk et al., 2002, Ulanova et al., 2003) и доматите. Понастоящем гените за вирулентност към картофените сортове са загубили своята стойност като маркери за изследване на популацията поради появата на максималния (или близък до него) брой вирулентни гени в по-голямата част от изолатите. В същото време генът за вирулентност Т1 за сортовете домати, носещи съответния Ph1 ген, все още се използва успешно като маркерна характеристика (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al., 2003).
В много проучвания фунгицидната устойчивост се използва като маркер. Тази черта е нежелана за използване в популационни проучвания поради доста лесната поява на мутации на резистентност в клонални линии след прилагането на металаксил- (или мефеноксам-), съдържащи фунгициди в полето. Например, значителни разлики в нивото на резистентност са показани в рамките на клоналната линия Sib1 (Elansky et al., 2001).
По този начин, тип на чифтосване, пептидазен изоензимен спектър, тип митохондриална ДНК, RFLP-RG57, SSR са предпочитаните маркери за създаване на банки данни и маркиране на щамове в колекции. За да сравните ограничени проби, ако е необходимо да приложите максималния брой маркери, можете да използвате AFLP, RAPD, InterSSR, Inter-SINE PCR (Таблица 5). Трябва обаче да се помни, че тези методи са слабо възпроизводими и във всеки отделен експеримент (цикъл на амплификационна електрофореза) е необходимо да се използват няколко референтни изолата.
Таблица 5. Сравнение на различни методи за изследване на щамове P. infestans
критерий | TS | Ченгета от Изофер | МтДНК | RFLP-RG57 | RAPD | ISSR | SSR | AFLP | оборот |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Количество информация | Н | Н | Н | С | В | В | С | В | В |
Възпроизводимост | В | В | В | В | Н | Н | С | С | С |
Възможност за артефакти | Н | Н | Н | Н | В | С | Н | С | В |
Цена | Н | С | Н | В | Н | Н | Н | С | Н |
Интензивност на труда | Н | Н | Н | В | NS * | NS * | Н | С | NS * |
Скорост на анализ ** | В | Н | Н | С | Н | Н | Н | Н | Н |
Забележка: H - ниско, C - средно, B - високо; НС * - интензивността на труда е ниска, когато се използва агарозен гел или автоматично
генотип, средна - чрез дестилация в полиакриламиден гел с маркирани праймери,
** - без да се брои времето, отделено за отглеждане на мицел за изолиране на ДНК.
Структура на населението
Клонални линии
При липса на рекомбинация или нейния незначителен принос в структурата на популацията, популацията се състои от определен брой клонинги, генетичният обмен между които е изключително рядък.
В такива популации е по-информативно да се изследват не честотите на отделни гени, а честотите на генотипове, които имат общ произход (клонални линии или клонални линии) и се различават само по точкови мутации. Изследванията на популацията на патогена на късната болест и анализът на клоналните линии значително се ускориха от появата на метода RFLP-RG57 в началото на 90-те години на миналия век. Заедно с RFLP-RG57, типът на чифтосване, спектрите на изоензимите на пептидаза и глюкозо-6-фосфат изомераза и типа на митохондриалната ДНК се използват за идентифициране на клонални линии. Характеристиките на най-често срещаните клонални линии са показани в Таблица 6.
Клонът US-1 доминираше популациите навсякъде до края на 80-те години, след което започна да бъде заместван от други клонинги и изчезва от Европа и Северна Америка. Сега се среща в Далечния изток (Филипини, Тайван, Китай, Япония, Корея, Koh et al., 1994, Mosa et al, 1993), в Африка (Уганда, Кения, Руанда, Goodwin et al, 1994, Vega-Sanchez et al., 2000; Ochwo et al., 2002) и в Южна Америка (Еквадор, Бразилия, Перу, Forbes et al., 1997, Goodwin et al., 1994). Само в Австралия не са идентифицирани щамове, принадлежащи към линията US-1. Очевидно изолатите на P. infestans са дошли в Австралия с друга миграционна вълна (Goodwin, 1997).
Клонът US-6 мигрира от Северно Мексико до Калифорния в края на 70-те години и предизвика епидемия от картофи и домати след 32 години без болести. Поради високата си агресивност той измести клонинга на САЩ-1 и започна да доминира на западното крайбрежие на Съединените щати (Goodwin et al., 1995a).
Генотипите US-7 и US-8 са открити в САЩ през 1992 г., а вече през 1994 г. са широко разпространени в САЩ и Канада. По време на един полеви сезон клонингът US-8 е в състояние почти напълно да измести клонинга US-1 в картофени парцели, първоначално заразени с двата клонинга при еднаква концентрация (Miller and Johnson, 2000).
Клонинги BC-1 до BC-4 са идентифицирани в Британска Колумбия в малък брой изолати от Goodwin et al., 1995b). Клон US-11 се разпространява широко в САЩ и измества US-1 в Тайван. Клоновете JP-1 и EC-1, заедно с клонинга US-1, са често срещани съответно в Япония и Еквадор (Koh et al., 1994; Forbes et al., 1997).
SIB-1 е клонинг, който преобладава в Русия над огромна територия от Московска област до Сахалин. В Московския регион е открит през 1993 г. и някои популации на полето се състоят главно от щамове от тази клонова линия, силно устойчиви на металаксил. След 1993 г. разпространението на този клон намалява значително. Извън Урал през 1997-1998 г. SIB-1 е намерен навсякъде, с изключение на Хабаровската територия (там е широко разпространен клонингът SIB-2). Пространственото разделяне на клонингите с различни видове чифтосване изключва сексуалния процес в Сибир и Далечния изток. В региона на Москва, за разлика от Сибир, населението е представено от много клонинги; почти всеки изолат има уникален многолокусен генотип (Elansky et al., 2001, 2015). Това разнообразие не може да се обясни единствено с вноса на щамове на гъбичките от различни части на света с внесен семенен материал. Тъй като и двата вида чифтосване се срещат в популацията, възможно е разнообразието му да се дължи и на рекомбинация. По този начин в Британска Колумбия се предполага появата на генотипове BC-2, BC-3 и BC-4 поради хибридизация на клонинги BC-1 и US-6 (Goodwin et al., 1995b). Възможно е хибридни щамове да бъдат открити в московските популации. Например, щамовете MO-4, MO-8 и MO-11 хетерозиготни за PEP локуса могат да бъдат хибриди между щамове MO-12, MO-21, MO-22, имащи тип чифтосване А2 и хомозиготни за един алел на PEP локуса и щама MO-8, имащ тип чифтосване А1 и хомозиготен за друг алел на локуса. И ако това е така и в съвременните популации на P. infestans има тенденция към увеличаване на ролята на половия процес, тогава информационната стойност на анализа на мултилокусни клонинги ще намалее (Elansky et al., 2001, 2015).
Вариация в клонални линии
До 90-те години на 20-ти век клоновата линия US-1 е широко разпространена в света. Повечето от полските и регионалните популации се състоят изключително от щамове с генотип US-1. Въпреки това се наблюдават и разлики между изолатите, най-вероятно причинени от мутационен процес. Настъпили мутации както в ядрената, така и в митохондриалната ДНК и засегнали, наред с други неща, нивото на резистентност към фениламидни лекарства и броя на гените на вирулентност. Линиите, които се различават от оригиналните генотипове по мутации, се обозначават с допълнителни цифри след точката след името на оригиналния генотип (например US-1.1 мутантната линия на клоналната линия US-1). ДНК линиите за пръстови отпечатъци US-1.5 и US-1.6 съдържат аксесоарни линии с различни размери (Goodwin et al., 1995a, 1995b); клоналната линия US-6.3 също се различава от US-6 с една допълнителна линия (Goodwin, 1997, Таблица 7).
При изследването на митохондриална ДНК е установено, че в клоналната линия US-1 се открива само тип 1b на митохондриална ДНК (Carter et al., 1990). Въпреки това, при изследването на щамове от този клонов произход от Перу и Филипините бяха открити изолати, чиито митохондриални типове ДНК се различават от 1b по наличието на вмъквания и делеции (Goodwin, 1991, Koh et al., 1994).
Таблица 6. Мултилокусни генотипове на някои клонални линии на P. infestans
Име | Тип чифтосване | Изозими | ДНК пръстови отпечатъци | MtDNA тип | |
GPI | PEP | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010110011 24 + | Ib |
US-2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010010011 24 + | - |
US-3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111000000011 24 + | - |
US-4 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0111010010011 24 + | - |
US-5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111010010011 24 + | - |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111110010011 24 + | IIб |
US-7 | A2 | 100/111 | 100/100 | 1.0011000010011 24 + | Ia |
US-8 | A2 | 100/111/122 | 100/100 | 1.0011000010011 24 + | Ia |
US-9 | A1 | 100/100 | 83/100 | * | - |
US-10 | A2 | 111/122 | 100/100 | - | - |
US-11 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0101110010011 24 + | IIб |
US-12 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0001000010011 24 + | - |
US-14 | A2 | 100/122 | 100/100 | 1.0000000000011 24 + | - |
US-15 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 24 + | Ia |
US-16 | A1 | 100/111 | 100/100 | 1.0001100010011 24 + | - |
US-17 | A1 | 100/122 | 100/100 | 1.0100010000011 24 + | - |
US-18 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 24 + | Ia |
US-19 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010000011 24 + | Ia |
EC-1 | A1 | 90/100 | 96/100 | 1.1111010010011 24 + | Па |
СИБ-1 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011 24 + | Па |
СИБ-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011 24 + | Па |
СИБ-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.1001010100011 24 + | Па |
MO-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011 24 + | Па |
MO-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011 24 + | Ia |
MO-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101000010011 24 + | Па |
MO-4 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101110110011 24 + | Па |
MO-5 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001010010011 24 + | Па |
MO-6 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011 24 + | Ia |
MO-7 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000110011 24 + | Па |
MO-8 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0101100010011 24 + | Па |
MO-9 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 24 + | Па |
MO-10 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101100000011 24 + | Ia |
MO-11 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010010011 24 + | Ia |
MO-12 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011 24 + | Ia |
MO-13 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 24 + | Ia |
MO-14 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.01010010011 22 + | Ia |
MO-15 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.101110010011 23 + | Ia |
MO-16 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000000011 24 + | Па |
MO-17 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1.0101010110011 24 + | Ib |
MO-18 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101110010011 24 + | Па |
MO-19 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 24 + | Па |
MO-20 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 24 + | Па |
MO-21 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 24 + | Па |
Забележка: * - няма данни.
Таблица 7. Мултилокусни генотипове и техните мутантни линии
Име | Тип чифтосване | | ДНК пръстови отпечатъци (RG57) | Бележки | |
GPI | РЕР-1 | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101000110011 | Оригинален генотип 1 |
US-1.1 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101011001101000110011 | Мутация в PEP |
US-1.2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101010001101000110011 | Мутация в RG57 |
US-1.3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101001001101000110011 | Мутация в RG57 |
US-1.4 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101010001101000110011 | Мутация в RG57 и PEP |
US-1.5 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101010110011 | Мутация в RG57 |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010110011 | Оригинален генотип 2 |
US-6.1 | A1 | 100/100 | 92 /92 | 1011111001001100010110011 | Мутация в PEP |
US-6.2 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011101001001100010110011 | Мутация в RG57 |
US-6.3 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001011100010110011 | Мутация в RG57 |
US-6.4 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1011011001001100010110011 | Мутация в RG57 и PEP |
US-6.5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010010011 | Мутация в RG57 |
BR-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1011101000001100001111011 | Оригинален генотип 3 |
BR-1.1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1010101000001100001110011 | Мутация в RG57 |
Има и промени в спектрите на изозимите. По правило те се причиняват от разграждането на организма, първоначално хетерозиготен за този ензим, до хомозиготни. През 1993 г. върху плодовете от домати идентифицирахме щам с характеристики, характерни за US-1: RG57 пръстови отпечатъци, тип митохондриална ДНК и 86/100 генотип за глюкоза-6-фосфати-изомераза, но той беше хомозиготен (100/100) за първия пептидазен локус вместо типична за тази клонална линия хетерозигота 92/100. Назовахме генотипа на този щам MO-17 (Таблица 6). Мутантните линии US-1.1 и US-1.4 също се различават от US-1 по мутации в първия пептидазен локус (Таблица 7).
Мутациите, водещи до промени в броя на гените на вирулентност за сортовете картофи и домати, са доста често срещани. Те са отбелязани сред изолатите на клоналната линия US-1 в популации от Холандия (Drenth et al., 1994), Перу (Goodwin et al., 1995a), Полша (Sujkowski et al., 1991), Северна Северна Америка (Goodwin et al., ., 1995b). Различия в броя на картофените гени за вирулентност са отбелязани и сред изолатите на клоналните линии US-7 и US-8 в Канада и САЩ (Goodwin et al., 1995a), сред изолатите на линията SIB-1 в азиатската част на Русия (Elansky et al, 2001 ).
Изолати със силни разлики в нивата на резистентност към фениламидни лекарства са идентифицирани в моноклонални популации на полето, всички от които принадлежат към клоналната линия Sib-1 (Elansky et al, 2001, Таблица 1). Почти всички щамове на клоновата линия US-1 са силно чувствителни към металаксил; обаче, силно устойчиви изолати от тази линия са изолирани във Филипините (Koh et al., 1994) и в Ирландия (Goodwin et al., 1996).
Съвременни популации от P. infestans
Централна Америка (Мексико)
Популацията на P. infestans в Мексико се различава значително от останалите световни популации, което се дължи преди всичко на историческото му положение. Многобройни проучвания на тази популация и свързаните с нея видове P. infestans от кладата Phytophthora, както и местните видове от рода Solanum, доведоха до заключението, че еволюцията на патогена в централната част на Мексико е протичала заедно с еволюцията на растенията гостоприемници и е свързана със сексуална рекомбинация (Grünwald, Flier , 2005). И двата вида чифтосване са представени в популацията и в равни пропорции, а наличието на ооспори в почвата, върху растения и грудки от картофи и диви растения, свързани с вида Solanum потвърждава наличието на полов процес в популацията (Fernández-Pavía et al., 2002). Последните проучвания на долината на Толука и нейните околности (предполагаемият център за произход на патогена) потвърдиха високото генетично разнообразие на местната популация на P. infestans (134 мултилокусни генотипа в извадка от 176 проби) и наличието на няколко диференцирани субпопулации в региона (Wang et al., 2017). Факторите, допринасящи за тази диференциация, са пространственото разделение на субпопулациите, характерни за планинските райони в централно Мексико, разликите в условията на отглеждане и сортовете картофи, използвани в долините и планините, и наличието на диви грудкови видове Solanum, които могат да действат като алтернативни гостоприемници (Fry et al ., 2009).
Трябва обаче да се отбележи, че популациите на P. infestans в северно Мексико имат по-клонален характер и са по-подобни на популациите в Северна Америка, което може да показва, че това са новите генотипове (Fry et al., 2009).
Северна Америка
Северноамериканските популации на P. infestans винаги са имали много проста структура и техният клонален характер е установен много преди използването на микросателитен анализ. До 1987 г. клоновата линия US-1 доминира в САЩ и Канада (Goodwin et al., 1995). В средата на 70-те години, когато се появяват фунгицидите на базата на металаксил, този клонинг започва да се заменя с други, по-устойчиви генотипове, които са мигрирали от Мексико (Goodwin et al., 1998). До края на 90-те. генотипът US-8 напълно замени генотипа US-1 в Съединените щати и се превърна в доминиращата клонова линия върху картофите (Fry et al., 2009; Fry et al., 2015). Ситуацията беше различна при доматите, които постоянно съдържаха няколко клонални линии и съставът им се променяше от година на година (Fry et al., 2009).
През 2009 г. в САЩ избухна мащабна епидемия от късна болест върху домати. Характерна особеност на тази пандемия беше нейното почти едновременно начало на много места в североизточната част на САЩ и се оказа, че е свързано с масивни продажби на заразени разсад от домати в големи градински центрове (Fry et al., 2013). Загубите на реколта бяха огромни. Микросателитният анализ на засегнатите проби разкрива, че пандемичният щам принадлежи на клониращата линия US-22 А2 тип чифтосване. През 2009 г. делът на този генотип в американската популация на P. infestans достигна 80% (Fry et al., 2013). През следващите години делът на агресивните генотипове US-23 (главно върху доматите) и US-24 (върху картофите) непрекъснато се увеличава в популацията, но след 2011 г. степента на откриване на US-24 намалява значително и към днешна дата около 90% от популацията на патогените в Съединените щати са представени от генотипа US-23 (Fry et al., 2015).
В Канада, както и в САЩ, в края на 90-те. доминиращият генотип US-1 е изместен от US-8, чието господстващо положение остава непроменено до 2008 г. В Канада имаше сериозни епидемии от късна болест, свързани с продажбата на заразени разсад от домати, но те бяха причинени от генотипите US-2009 и US-2010 (Kalischuk et al., 23). Ясната географска диференциация на тези генотипове беше забележителна: САЩ-8 доминираха в западните провинции на Канада (2012%), докато САЩ-23 доминираха в източните провинции (68%). През следващите години US-8 се разпространява в източните региони, но като цяло делът му в населението леко намалява на фона на появата на генотипове US-83 и US-23 в страната (Peters et al., 22). Към днешна дата САЩ-24 запазва господстващо положение в цяла Канада; US-2014 присъства в Британска Колумбия, докато US-23 и US-8 присъстват в Онтарио (Peters, 23).
По този начин северноамериканските популации на P. infestans са предимно клонални линии. През последните 40 години броят на откритите клонални генотипове достигна 24. Въпреки факта, че щамовете от двата вида чифтосване присъстват в популацията, вероятността от поява на нови генотипи в резултат на сексуална рекомбинация остава доста ниска. Въпреки това през последните 20 години са регистрирани няколко случая на поява на ефимерни рекомбинантни популации (Gavino et al., 2000; Danies et al., 2014; Peters et al., 2014), а в един случай резултатът от кръстосването е генотипът US-11 , който беше укрепен в Северна Америка в продължение на много години (Gavino et al., 2000). До 2009 г. промените в структурата на популациите бяха свързани с появата на нови, по-агресивни генотипове с последващата им миграция и изместване на предишни доминиращи предшественици. Какво се случи през 2009-2010 в САЩ и Канада за първи път епифитотиците показват, че в ерата на глобализацията огнищата на болестта могат да бъдат свързани с активното разпространение на нови генотипове при продажба на заразени посадъчни материали.
Южна Америка
Доскоро изследванията на южноамериканските популации на P. infestans не бяха нито редовни, нито мащабни. Известно е, че структурата на тези популации е доста проста и включва 1-5 клонални линии на държава (Forbes et al., 1998). Така до 1998 г. генотипите US-1 (Бразилия, Чили) BR-1 (Бразилия, Боливия, Уругвай, Парагвай), EC-1 (Еквадор, Колумбия, Перу и Венецуела), AR-1, AR са открити върху картофи -2, AR-3, AR-4 и AR-5 (Аржентина), PE-3 и PE-7 (южно Перу). Чифтосване тип А2 присъства в Бразилия, Боливия и Аржентина и не е открито отвъд боливийско-перуанската граница в района на езерото Титикака, зад което генотипът EC-1 A1 доминира в Андите. При доматите US-1 остава доминиращият генотип в цяла Южна Америка.
Ситуацията се запази горе-долу през 2000-те. Важен момент беше откриването на нова клонова линия EC-2 от тип А2 върху диви роднини на картофи (S. brevifolium и S. tetrapetalum) в Северните Анди (Oliva et al., 2010). Филогенетичните изследвания показват, че тази линия не е напълно идентична с P. infestans, въпреки че е тясно свързана с нея, в тази връзка беше предложено да се разгледа, както и друга линия, EC-3, изолирана от доматното дърво S. betaceum, растящо в Андите, нов вид, наречен P. andina; обаче, статутът на този вид (независим вид или хибрид от P. infestans с някаква все още неизвестна линия) все още е неясен (Delgado et al., 2013).
В момента всички популации от Южна Америка на P. infestans са клонални. Въпреки наличието и на двата вида чифтосване, не са установени рекомбинантни популации. При доматите генотипът US-1 е повсеместен, очевидно изместен от картофите от местни щамове, чийто точен произход все още не е известен. В Бразилия, Боливия и Уругвай присъства генотипът BR-1; в Перу, заедно с US-1 и EC-1, има още няколко местни генотипа. В Андите доминиращата позиция се запазва от клоналната линия EC-1, чиято връзка с наскоро откритата P. andina остава неизследвана. Единственото "нестабилно" място, където за периода 2003-2013г. имаше значителни промени в популацията, стана Чили (Acuña et al., 2012), където през 2004-2005. патогенната популация се характеризира с резистентност към металаксил и нов митохондриален ДНК хаплотип (Ia вместо предишния Ib). 2006 до 2011 в популацията доминира генотип 21 (според SSR), делът на който достига 90%, след което дланта преминава към генотип 20, честотата на появата на които през следващите две години се задържа на около 67% (Acuña, 2015).
Европа
В историята на Европа е имало поне две вълни на миграция на P. infestans от Северна Америка: през 1 век. (HERB-1) и началото на 70-ти век (US-1). Вездесъщото разпространение на металаксилсъдържащи фунгициди през XNUMX-те години. доведе до изместването на доминиращия генотип US-XNUMX и замяната му с нови генотипове. В резултат на това в повечето страни от Западна Европа популациите на патогена бяха представени главно от няколко клонални линии.
Използването на микросателитен анализ за анализ на патогенни популации даде възможност да се разкрият сериозни промени, настъпили в Западна Европа през 2005-2008 г. През 2005 г. в Обединеното кралство беше открита нова клонална линия, наречена 13_A2 (или „Blue 13“) и характеризираща се с тип чифтосване A2 , висока агресивност и устойчивост на фениламиди (Shaw et al., 2007). Същият генотип е открит в проби, събрани през 2004 г. в Холандия и Северна Франция, което предполага, че той е мигрирал във Великобритания от континентална Европа, вероятно със семенни картофи (Cooke et al., 2007). Изследването на генома на представители на тази клонова линия показа висока степен на полиморфизъм на нейната последователност (до 2016 г. броят на нейните субклонални вариации достигна 340) и значителна степен на вариация в нивото на генна експресия, вкл. ефекторни гени по време на инфекция с растения (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017). Тези характеристики, заедно с увеличената продължителност на биотрофната фаза, могат да причинят повишена агресивност на 13_A2 и способността му да заразява дори сортове картофи, устойчиви на късна болест.
През следващите няколко години генотипът бързо се разпространява в страните от Северозападна Европа (Великобритания, Ирландия, Франция, Белгия, Холандия, Германия) с едновременно изместване на доминиращите преди това генотипи 1_A1, 2_A1, 8_A1 (Montarry et al., 2010; Gisi et al. , 2011; Van den Bosch et al., 2011; Cooke, 2015; Cooke, 2017). Според уебсайта www.euroblight.net делът на 13_A2 в популациите на тези страни достига 60-80% и повече; присъствието на този генотип е регистрирано и в някои страни от Източна и Южна Европа. Въпреки това през 2009-2012г. 13_A2 загуби доминиращите си позиции във Великобритания и Франция, отстъпвайки на линията 6_A1 (8_A1 в Ирландия), а в Холандия и Белгия беше частично заменен от генотипове 1_A1, 6_A1 и 33_A2 (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017; Stellingwerf, 2017).
Към днешна дата около 70% от западноевропейската популация на P. infestans е моноклонална. Според уебсайта www.euroblight.net, доминиращите генотипове в страните от Северозападна Европа (Великобритания, Франция,
Холандия, Белгия) остават, приблизително в равни пропорции, 13_A2 и 6_A1, като последните практически не се срещат извън посочения регион (с изключение на Ирландия), но вече има поне 58 подклона (Cooke, 2017). Вариации 13_A2 присъстват в забележим брой в Германия и се наблюдават спорадично и в страните от Централна и Южна Европа. Генотип 1_A1 съставлява значителна част от популациите на Белгия и частично на Холандия и Франция. Генотип 8_A1 се стабилизира в европейското население на ниво от 3-6%, с изключение на Ирландия, където запазва водещата си позиция и е разделен на два подклона (Stellingwerf, 2017). И накрая, през 2016 г. беше отбелязано увеличаване на честотата на поява на нови генотипове 36_A2 и 37_A2, регистрирани за първи път през 2013-2014 г .; към днешна дата тези генотипове се срещат в Холандия и Белгия и отчасти във Франция и Германия, както и в южната част на Великобритания (Cooke, 2017). Приблизително 20-30% от западноевропейското население е представено от уникални генотипи всяка година.
За разлика от Западна Европа, по времето, когато се появи генотипът 13_A2, популациите на Северна Европа (Швеция, Норвегия, Дания, Финландия) бяха представени не от клонални линии, а от голям брой уникални генотипове (Brurberg et al.,
2011). По време на активното разпространение на 13_A2 в Западна Европа, присъствието на този генотип в Скандинавия не е отбелязано до 2011 г., когато за първи път е открит в Северна Ютландия (Дания), където се отглеждат предимно индустриални сортове картофи с активно използване на металаксилсъдържащи фунгициди (Nielsen et al., 2014). Според www.euroblight.net генотип 13_A2 е открит и в няколко проби от Норвегия и Дания през 2014 г. и в няколко норвежки проби през 2016 г .; освен това през 2013 г. във Финландия е отбелязано наличието на генотип 6_A1 в малко количество. Основната причина за провала на 13_A2 и други клонови линии при завладяването на Скандинавия се счита за климатичните различия на този регион от страните от Западна Европа.
В допълнение към факта, че хладното лято и студената зима насърчават оцеляването на не толкова вегетативния мицел, колкото ооспорите (Sjöholm et al., 2013), замръзването на почвата през зимата (което обикновено не се случва в по-топлите страни от Западна Европа) допринася за синхронизирането на покълването и засаждането на ооспорите. картофи, което засилва ролята им като източник на първична инфекция (Brurberg et al., 2011). Трябва също така да се отбележи, че в северните условия развитието на инфекция от ооспори изпреварва развитието на грудка инфекция, което в крайна сметка предотвратява господството на още по-агресивни, но по-късно развити клонални линии (Yuen, 2012). Структурата на най-изследваните популации на P. infestans в страните от Източна Европа (Полша, балтийските държави) е много подобна на тази в Скандинавия.
И двата вида чифтосване също присъстват тук и по-голямата част от генотипите, определени чрез SSR анализ, са уникални (Chmielarz et al., 2014; Runno-Paurson et al., 2016). Както в Северна Европа, разпределението на клоновите линии (предимно на генотипа 13_A2) практически не засяга местните популации на патогена, които запазват високо ниво на разнообразие с липсата на изразени доминиращи линии.
Присъствието на 13_A2 се наблюдава от време на време в полета с търговски сортове картофи. В Русия ситуацията се развива по подобен начин. Микросателитен анализ на изолатите на P. infestans, събрани през 2008-2011 г. в 10 различни региона на европейската част на Русия, показа висока степен на генотипно разнообразие и пълна липса на съвпадения с европейски клонални линии (Statsyuk et al., 2014). Няколко години по-късно, проучване на проби от P. infestans, събрани в Ленинградска област през 2013-2014 г., показва значителни разлики между тях и генотипите от този регион, идентифицирани в предишното проучване. И в двете проучвания не са открити западноевропейски генотипове (Beketova et al., 2014; Kuznetsova et al., 2016).
Високото генетично разнообразие на източноевропейските популации на P. infestans и липсата на доминиращи клонални линии в тях може да се дължи на няколко причини. Първо, както в Северна Европа, климатичните условия на разглежданите страни допринасят за образуването на ооспори като основен източник на инфекция (Ulanova et al., 2010; Chmielarz et al., 2014). Второ, значителна част от картофите, произведени в тези страни, се отглеждат в малки частни ферми, често заобиколени от гори или други пречки пред свободното движение на заразен материал (Chmielarz et al., 2014). По правило картофите, отглеждани в такива условия, практически не се третират с химикали и изборът на сортове се основава на тяхната устойчивост на късна болест, т.е. няма селективен натиск за агресивност и резистентност към металаксил, което лишава устойчивите генотипове, като 13_A2, от предимства пред други генотипове (Chmielarz et al., 2014). И накрая, поради малкия размер на парцелите, собствениците им обикновено не практикуват сеитбообращение, отглеждайки картофи на едно и също място в продължение на години, което допринася за натрупването на генетично разнообразен инокулум (Runno-Paurson et al., 2016; Elansky, 2015; Elansky et al. ., 2015).
Азия
Доскоро структурата на популациите на P. infestans в Азия оставаше сравнително слабо разбрана. Беше известно, че той е представен главно от клонални линии и ефектът от сексуалната рекомбинация върху появата на нови генотипи е много малък. Така например, през 1997-1998г. В азиатската част на Русия (Сибир и Далечния изток) популацията на патогените е представена само от три генотипа с преобладаване на генотипа SIB-1 (Elansky et al., 2001). Наличието на клонални патогенни линии е показано в страни като Китай, Япония, Корея, Филипините и Тайван (Koh et al., 1994; Chen et al., 2009). Клоновата линия US-1 доминира над голяма територия на Азия в края на 90-те - началото на 2000-те. почти навсякъде започнаха да се заменят с други генотипове, които от своя страна отстъпиха място на нови. В повечето случаи промените в структурата и състава на популациите в азиатските страни са свързани с миграцията на нови генотипове отвън. Така че, в Япония, с изключение на генотипа JP-3, всички други японски генотипове, появили се след US-1 (JP-1, JP-2, JP-3) имат повече или по-малко доказан външен произход (Akino et al., 2011) ... В Китай в момента има три основни патогенни популации с ясно географско разделение; Между тези популации няма или е много слаб генен поток (Guo et al., 2010; Li et al., 2013b). Генотип 13_A2 се появява на територията на Китай в южните му провинции (Юнан и Съчуан) през 2005-2007 г. и през 2012-1014 г. се наблюдава и в североизточната част на страната (Li et al., 2013b). В Индия 13_A2 се появява вероятно по същото време, както в Китай, най-вероятно със заразени семенни картофи (Chowdappa et al., 2015), и през 2009-2010. причини сериозно епифитотично заболяване късна болест по доматите в южната част на страната, след което се разпространи върху картофите и през 2014 г. предизвика огнище на късна болест в Западна Бенгалия, което доведе до разорение и самоубийство на много местни фермери (Fry, 2016).
Африка
До 2008-2010г не са провеждани систематични изследвания на P. infestans в африканските страни. Понастоящем африканските популации на P. infestans могат да бъдат разделени на две групи и това разделение е ясно свързано с факта, че семените картофи се внасят от Европа.
В Северна Африка, която активно внася семенни картофи от Европа, типът на чифтосване А2 е широко представен в почти всички региони, което предоставя теоретична възможност за появата на нови генотипи в резултат на сексуална рекомбинация (Corbière et al., 2010; Rekad et al., 2017). Освен това в Алжир се отбелязва наличието на генотипове 13_A2, 2_A1 и 23_A1 с подчертано доминиране на първия от тях, както и постепенно намаляване на дела на уникалните генотипове до пълно изчезване (Rekad et al., 2017). За разлика от останалата част от региона, в Тунис (с изключение на североизточната част на страната) популацията на патогените е представена главно от тип чифтосване А1 (Harbaoui et al., 2014).
Тук доминира клоновата линия NA-01. Като цяло делът на клоновите линии в популацията е само 43%. В Източна и Южна Африка, където обемът на вноса на семена е изчезващо малък (Fry et al., 2009), P. infestans е представен само от две клонални линии тип А1, US-1 и KE-1, а последната активно измества първата върху картофите ( Pule et al., 2012; Njoroge et al., 2016). Към днешна дата и двата генотипа имат забележим брой субклонални вариации.
Австралия
Първият доклад за късна болест върху картофите в Австралия датира от 1907 г., а първата епифитотия, вероятно причинена от обилни дъждове през летните месеци, се е случила през 1909-1911 г. (Drenth et al., 2002). Като цяло обаче късната болест няма значително икономическо значение за страната. Спорадични огнища на късна болест, провокирани от метеорологични условия, които осигуряват висока влажност, не се случват по-често от веднъж на 5-7 години и са локализирани главно в северната част на Тасмания и централна Виктория. Във връзка с гореизложеното на практика липсват публикации, посветени на изследването на структурата на австралийското население на P. infestans. Последната налична информация е от 1998-2000 г. (Drenth et al., 2002). Според авторите популацията на щата Виктория е клонална линия US-1.3, което косвено потвърждава миграцията на този генотип от САЩ. Тасманийските екземпляри бяха класифицирани като AU-3, различни от генотипите, които по това време присъстваха в други части на света.
Особености на развитието на късна болест в Русия
В Европа инфекцията, внесена с болни семенни грудки, ооспори, които са презимували в почвата, както и зооспорангии, донесени от вятъра от растения, отглеждани от презимували клубени на миналогодишните полета („доброволни“ растения), или върху купища отбранени, се считат за първичен инокулум върху картофите. отметка за съхранение на грудки. От тях растенията, отглеждани върху купища изхвърлени грудки, се считат за най-опасния източник на инфекция. там броят на покълналите клубени често е значителен и зооспорангиите могат да се пренасят от тях на големи разстояния. Останалите източници (ооспори, "доброволни" растения) не са толкова опасни, тъй като не е обичайно да се отглеждат растения в едни и същи полета по-често от веднъж на 3-4 години. Инфекцията от болни клубени на семена също е минимална поради добрата система за контрол на качеството на семената.
Като цяло количеството инокулум в европейските популации е ограничено и следователно нарастването на епидемията е доста бавно и може успешно да се контролира с помощта на химически фунгицидни препарати. Основната задача в европейските условия е борбата с инфекцията във фазата, когато започва масовото разпръскване на зооспорангията от засегнатите растения.
В Русия ситуацията е коренно различна. По-голямата част от реколтата от картофи и домати се отглежда в малки частни градини; защитни мерки или изобщо не се извършват върху тях, или фунгицидните обработки се извършват в недостатъчен брой и започват след появата на късна болест по върховете. В резултат на това частните зеленчукови градини действат като основен източник на инфекция, от която зооспорангиите се пренасят от вятъра до търговски насаждения. Това се потвърждава от нашите преки наблюдения в областите Москва, Брянск, Кострома, Рязан: увреждане на растенията в частни градини се наблюдава дори преди началото на фунгицидното третиране на търговски насаждения. Впоследствие епидемията в големи полета се ограничава от използването на фунгицидни препарати, докато в частните градини има бързо развитие на късна болест.
В случай на неправилно или „бюджетно“ третиране на търговски насаждения, на полетата се появяват и огнища на късна болест; по-късно те се развиват активно, обхващайки все по-големи области (Elansky, 2015). Заразяването в частни градини оказва значително влияние върху епидемиите в търговските области. Във всички региони за отглеждане на картофи в Русия площта, заета от картофи в частни градини, е няколко пъти по-голяма от общата площ на полетата на големите производители. В такава среда частните зеленчукови градини могат да се разглеждат като глобален ресурс за инокулум за търговски полета. Нека се опитаме да идентифицираме тези свойства, които са характерни за генотипите на щамовете в частните градини.
Засаждане на семена и карантинен контрол на картофи за хранене, семена от домати, получени от съмнителни чуждестранни производители, дългосрочно отглеждане на картофи и домати в същите райони, неправилно третиране с фунгициди или пълното им отсъствие водят до тежки епифитотии в частния сектор, резултатът от които е безплатен кръстосване, хибридизация и образуване на ооспори в частни градини. В резултат се наблюдава много високо генотипично разнообразие на патогена, когато почти всеки щам е уникален по своя генотип (Elansky et al., 2001, 2015). Засаждането на семенни картофи от различен генетичен произход прави малко вероятно появата на клонални линии, специализирани за атака на определен сорт. Избраните в такъв случай щамове се отличават със своята гъвкавост по отношение на засегнатите сортове, повечето от тях имат близък до максималния брой гени за вирулентност. Това е много различно от системата на "клонални линии", характерна за големи полета на селскостопански предприятия с правилно инсталирана система за защита срещу късна болест. "Клоналните линии" (когато всички щамове на патогена на късната болест в полето са представени от един или няколко генотипа) са повсеместни в страни, където отглеждането на картофи се извършва изключително от големи ферми: САЩ, Холандия, Дания и др. В Англия, Ирландия, Полша, където домакинствата отглеждане на картофи, има и по-високо генотипно разнообразие в частните градини. В края на 20-ти век „клоналните линии“ са широко разпространени в азиатските и далекоизточните части на Русия (Elansky et al., 2001), което очевидно се дължи на използването на същите сортове картофи изключително за засаждане. Напоследък ситуацията в тези региони също започна да се променя към увеличаване на генотипното разнообразие на популациите.
Липсата на интензивно третиране с фунгицидни препарати има и друга, пряка последица - няма натрупване на устойчиви щамове в градините. Наистина нашите резултати показват, че устойчиви на металаксил щамове се срещат значително по-рядко в частните градини, отколкото в търговските насаждения.
Непосредствената близост на насаждения от картофи и домати, характерна за частните градини, улеснява миграцията на щамове между тези култури, в резултат на което през последното десетилетие сред щамовете, изолирани от картофи, делът на щамовете, носещи гена за устойчивост към сортовете черешови домати (Т1), характерни преди това само за " домат "щамове. Щамове с гена Т1 в повечето случаи са силно агресивни както към картофите, така и към доматите.
През последните години късната болест по доматите започна да се появява в много случаи по-рано, отколкото при картофите. Разсадът от домати може да бъде заразен с ооспори в почвата или ооспори, присъстващи в семената на домати или прилепнали към тях (Rubin et al., 2001). През последните 15 години в магазините се появиха голям брой евтини пакетирани семена, главно внос, към чиято употреба са преминали повечето от малките производители. Семената могат да донесат щамове с генотипове, типични за регионите на тяхното отглеждане. В бъдеще тези генотипове са включени в сексуалния процес в частни градини, което води до появата на напълно нови генотипове.
По този начин може да се твърди, че частните градини са глобален „топилен съд“, в който в резултат на обмена на генетичен материал се обработват съществуващи генотипове и се появяват напълно нови. В същото време техният подбор се извършва при условия, които са много различни от тези, създадени за картофи в големи ферми: липса на фунгицидна преса, сортова еднородност на насажденията, преобладаване на растенията, засегнати от различни форми на вирусна и бактериална инфекция, близост до домати и диви нощници, активно кръстосване и образуване на ооспори, възможността за ооспорите да действат като източник на инфекция през следващата година.
Всичко това води до много високо генотипно разнообразие на популациите в задния двор. При епифитотични условия късната болест се разпространява много бързо в зеленчуковите градини и се отделят огромни количества спори, които летят до близките търговски насаждения. Въпреки това, след като са навлезли в търговските полета с правилната система на земеделска технология и химическа защита, пристигналите спори практически нямат възможност да инициират епифитотика на полето, което се дължи на липсата на клонови линии, устойчиви на фунгициди и специализирани за култивирания сорт.
Друг източник на първичен инокулум могат да бъдат болните клубени, уловени в търговски разсад. Тези клубени се отглеждат, като правило, в полета с добри земеделски технологии и интензивна химическа защита. Генотиповете на изолатите, засегнали клубените, са адаптирани към развитието на техния собствен сорт. Тези щамове са значително по-опасни за търговско засаждане, отколкото инокулум с произход от частни градини. Резултатите от нашите изследвания също подкрепят това предположение. Популациите, изолирани от големи полета с правилно проведена химическа защита и добри земеделски технологии, не се различават по високо генотипно разнообразие. Често това са няколко клонални линии, които са силно агресивни.
Щамовете от търговски семенен материал могат да навлизат в популациите в зеленчукови градини и да участват в процесите, протичащи в тях. В една зеленчукова градина обаче тяхната конкурентоспособност ще бъде много по-ниска, отколкото в търговската област и скоро те ще престанат да съществуват под формата на клонална линия, но техните гени могат да бъдат използвани в популацията „градина“.
Инфекцията, която се развива върху "доброволни" растения и върху купища отбранени грудки по време на прибирането на реколтата, не е толкова важна за Русия, тъй като В основните региони за отглеждане на картофи в Русия се наблюдава дълбоко зимно замръзване на почвата и рядко се развиват растения от грудки, които са зимували в почвата. Освен това, както показват нашите експерименти, патогенът на късната болест не оцелява при отрицателни температури дори на грудки, които са запазили своята жизнеспособност. В сухия пояс, където се практикува отглеждането на ранни картофи, късната болест е доста рядка поради сухия и горещ вегетационен период.
По този начин понастоящем наблюдаваме разделението на популациите на P. infestans на „полеви“ и „градински“. През последните години обаче се наблюдават процеси, водещи до сближаване и взаимопроникване на генотипове от тези популации.
Сред тях може да се отбележи общо повишаване на грамотността на малките производители, появата на достъпни малки опаковки от семенни картофи, разпространението на фунгицидни препарати в малки опаковки и загубата на страх от „химия” от населението.
Възникват ситуации, когато благодарение на енергичната дейност на един доставчик цели села са засадени със семенни грудки от същия сорт и снабдени с малки опаковки от същите пестициди. Може да се предположи, че картофи от същия сорт ще бъдат намерени на търговски насаждения наблизо.
От друга страна, някои компании за търговия с пестициди насърчават „бюджетни“ схеми за химическо третиране. В този случай броят на препоръчаните обработки се подценява и се предлагат най-евтините фунгициди, като акцентът не е върху предотвратяването на развитието на късна болест до косене на върховете, а върху известно забавяне на епифитотията с цел увеличаване на добива. Такива схеми са икономически обосновани при отглеждане на картофи за хранене от нискокачествен семенен материал, когато по принцип не става въпрос за получаване на висок добив. В този случай обаче, за разлика от градинските популации, нивелираният генетичен фон на картофа допринася за избора на специфични физиологични раси, които са много опасни за този сорт.
Като цяло тенденциите към сближаване на "градински" и "полеви" методи за производство на картофи ни се струват доста опасни. За да се предотвратят отрицателните им последици както в битовия, така и в търговския сектор, ще е необходимо да се контролира както асортиментът от семенни картофи, така и асортиментът от фунгициди, предлагани на частни собственици в малки опаковки, както и проследяване на схемите за защита на картофите и използването на фунгицидни препарати в търговския сектор.
В областите на частния сектор се наблюдава интензивно развитие не само на късната болест, но и на Alternaria. Повечето собственици на частни парцели не предприемат специални мерки за защита срещу Alternaria, като погрешно разработват Alternaria за естествено увяхване на върховете или развитие на късна болест. Следователно, с масовото развитие на Alternaria върху възприемчиви сортове, домакинските парцели могат да служат като източник на инокулум за търговски насаждения.
Механизми на променливост
Процес на мутация
Тъй като появата на мутации е случаен процес, протичащ с ниска честота, появата на мутации във всеки локус зависи от честотата на мутация на този локус и размера на популацията. При изучаване на честотата на мутации на щамовете P. infestans обикновено се определя броят на колониите, отглеждани на селективни хранителни среди след третиране с химически или физически мутагени. Както се вижда от данните, представени в таблица 8, честотата на мутация на един и същ щам при различни локуси може да се различава с няколко порядъка. Високата честота на мутации в резистентност към металаксил може да бъде една от причините за натрупването на щамове, устойчиви на него в природата.
Честотата на спонтанни или индуцирани мутации, изчислена въз основа на лабораторни експерименти, не винаги съответства на процесите, протичащи в естествени популации, поради следните причини:
1. При асинхронни ядрени цепки е невъзможно да се оцени честотата на мутациите на ядрено поколение. Следователно повечето експерименти предоставят информация само директно за честотата на мутациите, без да се прави разлика между две мутационни събития и едно събитие след митоза.
2. Едноетапните мутации обикновено намаляват баланса на генома, поради което заедно с придобиването на ново свойство намалява и цялостната годност на организма. Повечето от експериментално получените мутации имат намалена агресивност и не се регистрират в естествени популации. По този начин коефициентът на корелация между степента на резистентност на мутантите на P. infestans към фунгициди с фениламид и скоростта на растеж в изкуствена среда е средно (-0,62), а устойчивостта на фунгициди и агресивността върху картофените листа (-0,65) (Derevyagina et al. , 1993), което показва ниската годност на мутантите. Мутациите в резистентност към диметоморф също са придружени от рязко намаляване на жизнеспособността (Bagirova et al., 2001).
3. По-голямата част от спонтанните и индуцирани мутации са рецесивни и не се проявяват фенотипно в експериментите, но представляват скрит резерв от вариабилност в естествените популации. Мутантните щамове, изолирани в лабораторни експерименти, носят доминиращи или полудоминантни мутации (Kulish и Dyakov, 1979). Очевидно ядрената диплоидия обяснява неуспешните опити за получаване на мутанти под въздействието на ултравиолетово облъчване, които са вирулентни към по-рано устойчиви сортове (McKee, 1969). Според изчисленията на автора подобни мутации могат да се появят с честота по-малка от 1: 500000 XNUMX. Преходът на рецесивни мутации към хомозиготно, фенотипично изразено състояние може да възникне поради сексуална или безполова рекомбинация (вж. По-долу). Въпреки това, дори и в този случай мутацията може да бъде маскирана от доминиращите алели на ядрата от див тип в ценотичния (многоядрен) мицел и финотипично фиксирана само по време на образуването на мононуклеарни зооспори.
Таблица 8. Честота на мутации на P. infestans към инхибиращи растежа вещества под действието на нитрозометилуреа (Dolgova, Dyakov, 1986; Bagirova et al., 2001)
Връзка | Честота на мутация |
Окситетрациклин | 6,9 10 х-8 |
Blasticidin S | 7,2 х 10-8 |
Стрептомицин | 8,3 x10-8 |
трихотецин | 1,8 10 х-8 |
Циклохексимид | 2,1 10 х-8 |
Дааконил | <4 x 10-8 |
Диметоморф | 6,3 10 х-7 |
Metalaxil | 6,9 10 х-6 |
Размерът на популацията също играе решаваща роля за появата на спонтанни мутации. При много големи популации, при които броят на клетките N> 1 / a, където a е скоростта на мутация, мутацията престава да бъде случайно явление (Kvitko, 1974).
Изчисленията показват, че при средно нападение на картофено поле (35 петна на растение), на един хектар се образуват 8x1012 спори дневно (Dyakov and Suprun, 1984). Очевидно такива популации съдържат всички мутации, разрешени от вида на обмена във всеки локус. Дори рядка мутация, която се случва с честота 10-9, ще бъде придобита от хиляда индивиди от милиони, живеещи на един хектар картофено поле. За мутации, възникващи с по-висока честота (например 10-6), в такава популация могат да се появят ежедневно различни сдвоени мутации (едновременно в два локуса), т.е. мутационният процес ще замени рекомбинацията.
миграции
За P. infestans са известни два основни типа миграция: за затваряне на разстояния (в рамките на картофено поле или съседни полета) чрез разпространение на зооспорангии чрез въздушни течения или дъждовни пръски и на големи разстояния - със засаждане на грудки или транспортирани плодове от домати. Първият метод предвижда разширяване на фокуса на болестта, вторият - създаване на нови огнища на места, отдалечени от първичната.
Разпространението на инфекция с домати и грудки не само допринася за появата на болестта на нови места, но е и основният източник на генетично разнообразие в популациите. В Московска област се отглеждат картофи, донесени от различни региони на Русия и Западна Европа. Доматите се донасят от южните райони на Русия (Астраханска област, Краснодарска територия, Северен Кавказ). Доматните семена, които също могат да служат като източник на инфекция (Rubin et al., 2001), също се внасят от южните райони на Русия, Китай, европейски страни и други страни.
Според изчисленията на E. Mayr (1974), генетичните промени в местната популация, причинени от мутации, рядко надвишават 10-5 на локус, докато при отворени популации обменът поради контрапотока на гените е поне 10-3 - 10-4.
Миграцията в заразените грудки е отговорна за навлизането на P. infestans в Европа, като се разпространява във всички региони на света, където се отглеждат картофи; те предизвикаха най-сериозните промени в населението. Късна болест върху картофите се появява на територията на Руската империя почти едновременно с появата й в Западна Европа.
Тъй като болестта е забелязана за първи път през 1846-1847 г. в балтийските държави и едва през следващите години се разпространява в Беларус и северозападните райони на Русия, западноевропейският й произход е очевиден. Първият източник на късна болест в Стария свят не е толкова очевиден. Хипотезата, разработена от Fry et al. (Fry et al., 1992; Fry, Goodwin, 1995, Goodwin et al., 1994) предполага, че паразитът първо е дошъл от Мексико в Северна Америка, където се е разпространил върху култури, а след това е транспортиран в Западна Европа (фиг. 7).
В резултат на многократния дрейф (двоен ефект на „тесното гърло“) единични клонинги попаднаха в Европа, чието потомство предизвика пандемия по цялата територия на Стария свят, където се отглеждат картофи. Като доказателство за тази хипотеза авторите цитират, първо, повсеместната поява само на един вид чифтосване (А1) и, второ, хомогенността на генотипите на изследваните щамове от различни региони (всички те се основават на молекулярни маркери, включително 2 изозимни локуса, модели на ДНК пръстови отпечатъци и структурата на митохондриалната ДНК са идентични и съответстват на клона US-1, описан в САЩ). Някои данни обаче пораждат съмнения относно поне някои от разпоредбите на посочената хипотеза. Анализът на митохондриалната ДНК на P. infestans, изолирана от хербарийни картофени проби, заразени през първия епифитотичен период през 40-те години, показва, че те се различават в структурата на митохондриалната ДНК от клонинг US-1, който следователно е поне не единственият източник на инфекция в Европа (Ristaino et al, 2001).
Ситуацията с късна болест отново се влоши през 80-те години на XX век. Настъпиха следните промени:
1) Средната агресивност на популацията се е увеличила, което е довело, по-специално, до широко разпространение на най-вредната форма на късна болест - увреждане на дръжките и стъблата.
2) Имаше промяна във времето на късна болест по картофите - от края на юли до началото на юли и дори до края на юни.
3) Типът чифтосване А2, който преди е отсъствал в Стария свят, е станал повсеместен.
Промените са предшествани от две събития: масовото използване на новия фунгицид металаксил (Schwinn и Staub, 1980) и появата на Мексико като световен износител на картофи (Niederhauser, 1993). В съответствие с това бяха изложени две причини за промените в популацията - преобразуване на типа на чифтосване под въздействието на металаксил (Ko, 1994) и масовото въвеждане на нови щамове със заразени грудки от Мексико (Fry и Goodwin, 1995). Въпреки че взаимните преобразувания на типове чифтосване под въздействието на металаксил са получени не само от Ko, но и в работи, проведени в лабораторията на Московския държавен университет (Савенкова, Черепенникова-Аникина, 2002), втората хипотеза е за предпочитане. Заедно с появата на втория тип чифтосване, настъпиха сериозни промени в генотипите на руските щамове P. infestans, включително в неутрални гени (изозим и локуси RFLP), както и в структурата на митохондриалната ДНК. Комплексът от тези промени не може да бъде обяснен с действието на металаксил; по-скоро е налице масивен внос на нови щамове от Мексико, които, като са по-агресивни (Kato et al., 1997), изместват старите щамове (US-1), ставайки доминиращи в популациите. Промяната в състава на европейското население е станала за много кратко време - от 1980 до 1985 г. (Fry et al., 1992). На територията на бившия СССР „нови щамове“ са открити в колекции от Естония през 1985 г., т.е. по-рано от Полша и Германия (Goodwin et al., 1994). За последен път "старият щам US-1" в Русия беше изолиран от заразен домат в Московска област през 1993 г. (Dolgova et al., 1997). Също така във Франция „стари“ щамове са били открити в насажденията на домати до началото на 90-те години, т.е. след като те отдавна са изчезнали върху картофите (Leberton and Andrivon, 1998). Промените в щамовете на P. infestans засегнаха много признаци, включително тези с голямо практическо значение, и увеличиха вредността на късната болест.
Сексуална рекомбинация
За да може сексуалната рекомбинация да допринесе за променливостта, е необходимо, първо, наличието на два вида чифтосване в популацията в съотношение, близко до 1: 1, и, второ, наличието на първоначална променливост на популацията.
Съотношението на типове чифтосване варира значително в различните популации и дори в различните години в една популация (Таблица 9,10, 90). Причините за такива драстични промени в честотата на чифтосване на видове в популациите (като например в Русия или в Израел в началото на 2002-те години на миналия век) са неизвестни, но се смята, че това се дължи на въвеждането на по-конкурентни клонинги (Cohen, XNUMX).
Някои косвени данни показват хода на сексуалния процес през определени години и в определени региони:
1) Изследвания на популации от Московска област показват, че в 13 популации, в които делът на чифтосване тип А2 е по-малък от 10%, общото генетично разнообразие, изчислено за три изозимни локуса, е 0,08, а в 14 популации, в които делът на А2 надвишава 30%, генетичното разнообразие е два пъти по-високо (0,15) (Elansky et al., 1999). По този начин, колкото по-голяма е вероятността за полов акт, толкова по-голямо е генетичното разнообразие на популацията.
2) Връзката между съотношението на типове чифтосване в популациите и интензивността на образуването на ооспори е наблюдавана в Израел (Cohen et al., 1997) и в Холандия
(Flier et al., 2004). Нашите проучвания показаха, че в популации, в които изолати с тип чифтосване A2 представляват 62, 17, 9 и 6%, ооспори са открити съответно в 78, 50, 30 и 15% от анализираните картофени листа (с 2 или повече петна).
Пробите с 2 или повече петна са много по-склонни да съдържат ооспори, отколкото проби с 1 петно (съответно 32 и 14% от пробите) (Apryshko et al., 2004).
Ооспорите са били много по-често срещани в листата на средния и долния слой на картофеното растение (Mytsa et al., 2015; Elansky et al., 2016).
3) В някои региони са открити уникални генотипове, появата на които е свързана със сексуална рекомбинация. По този начин в Полша през 1989 г. и във Франция през 1990 г. щамове, хомозиготни за глюкоза-6-
фосфатна изомераза (GPI 90/90). Тъй като по-рано само 10/90 хетерозиготи са били срещани в продължение на 100 години, хомозиготността се дължи на сексуалната рекомбинация (Sujkowski et al., 1994). В Колумбия (САЩ) изолатите, комбиниращи А2 с GPI 100/110 и А1 с GPI 100/100, са често срещани, но в края на сезон 1994 (16 август и 9 септември) щамове с рекомбинантни генотипове (A1 GPI 100/110 и A2 GPI 100/100) (Miller et al., 1997).
4) При някои популации от Полша (Sujkowski et al., 1994) и Северен Кавказ (Amatkhanova et al., 2004), разпределението на локусите на ДНК на пръстови отпечатъци и алозимните протеинови локуси съответства на разпределението на Hardy-Weinberg, което показва
за високия дял на приноса на сексуалната рекомбинация към променливостта на популациите. В други региони на Русия не е открито съответствие с разпределението на Харди-Вайнберг в популациите, но е доказано наличието на неравновесие на връзката, което показва преобладаване на клоновата репродукция (Elansky et al., 1999).
5) Генетичното разнообразие (GST) между щамове с различни типове чифтосване (А1 и А2) е по-ниско, отколкото между различните популации (Sujkowski et al., 1994), което косвено показва сексуални кръстоски.
В същото време приносът на сексуалната рекомбинация към разнообразието на населението не може да бъде много висок. Този принос е изчислен за популациите на региона на Москва (Elansky et al., 1999). Според изчисленията на Lewontin (1979), „рекомбинацията, която може да произведе нови варианти от два локуса с честота, която не надвишава произведението на техните хетерозиготности, става ефективна само ако стойностите на хетерозиготността и за двата алела са вече високи“.
Със съотношението на двата вида сдвояване, характерно за региона на Москва, равно на 4: 1, рекомбинационната честота ще бъде 0,25. Вероятността кръстосаните щамове да бъдат хетерозиготни за два от трите изследвани изозимни локуса в изследваните популации е 0,01 (2 щама от 177). Следователно вероятността за поява на двойни хетерозиготи в резултат на рекомбинация не трябва да надвишава техния продукт, умножен по вероятността за кръстосване (0,25x0,02x0,02) = 10-4, т.е. сексуалните рекомбинанти обикновено не попадат в изследваната проба от щамове. Тези изчисления са направени за популации от региона на Москва, характеризиращи се с относително висока вариабилност. В мономорфни популации като сибирските, половият процес, дори и да се проявява в отделни популации, не може да повлияе на тяхното генетично разнообразие.
В допълнение, P. infestans се характеризира с честа хромозомна грешка в мейозата, което води до анеуплоидия (Carter et al., 1999). Такива нарушения намаляват плодовитостта на хибридите.
Парасексуална рекомбинация, митотична генна конверсия
В експерименти върху сплайсинг на щамове P. infestans с мутации в резистентност към различни инхибитори на растежа е установено появата на мизолати, устойчиви на двата инхибитора (Shattock and Shaw, 1975; Dyakov, Kuzovnikova, 1974; Kulish, Dyakov,
1979). Щамове, устойчиви на два инхибитора на растежа, са възникнали в резултат на хетерокариотизация на мицела и в този случай те са се разцепили по време на размножаването от моноядрени зооспори (Judelson, Ge Yang, 1998) или не са се разцепили в монозооспорови потомци, тъй като са имали тетраплоидни (тъй като първоначалните изолати са диплоидни) ядра (К , 1979). Хетерозиготни диплоиди се сегрегират с много ниска честота поради хаплоидизация, хромозомна недисюнкция и митотично кръстосване (Poedinok et al., 1982). Честотата на тези процеси може да бъде увеличена с помощта на определени ефекти върху хетерозиготни диплоиди (например UV облъчване на покълващи спори).
Въпреки че образуването на вегетативни хибриди с двойна резистентност се случва не само in vitro, но и в картофени клубени, заразени със смес от мутанти (Kulish et al., 1978), е доста трудно да се оцени ролята на парасексуалната рекомбинация при генерирането на нови генотипове в популациите. Честотата на образуване на сегреганти поради хаплоидизация, недизюнкция на хромозомите и митотично пресичане без специални ефекти е незначителна (по-малко от 10-3).
Появата на хомозиготни сегреганти на хетерозиготни щамове може да се основава както на митотично кръстосване, така и на митотично генно преобразуване, което при P. sojae се случва с честота от 3 х 10-2 до 5 х 10-5 на локус, в зависимост от щама (Chamnanpunt et al. , 2001).
Въпреки че честотата на поява на хетерокариони и хетерозиготни диплоиди се оказа неочаквано висока (достигайки десетки проценти), този процес се случва само когато мутантните култури, получени от същия щам, се снаждат. При използване на различни щамове, изолирани от природата, не се получава хетерокариотизация (или се случва с много ниска честота) поради наличието на вегетативна несъвместимост (Poedinok and Dyakov, 1981; Anikina et al., 1997b; Cherepennikova-Anikina et al., 2002). Следователно, ролята на парасексуалната рекомбинация може да бъде намалена само до интраклонална рекомбинация в хетерозиготни ядра и преход на отделни гени в хомозиготно състояние без сексуален процес. Този процес може да има епидемиологично значение при щамове с рецесивни или полудоминиращи мутации на резистентност към фунгициди. Преминаването му в хомозиготно състояние поради парасексуалния процес ще увеличи съпротивлението на носителя на мутацията (Долгова, Дяков, 1986).
Интрогресия на гени
Хетеротални видове Phytophthora са способни да се кръстосват с образуването на хибридни ооспори (вж. Vorob'eva и Gridnev, 1983; Sansome et al., 1991; Veld et al., 1998). Естественият хибрид на двата вида Phytophthora е бил толкова агресивен, че е убил хиляди елши във Великобритания (Brasier et al., 1999). P. infestans може да се появи с други видове от рода (P. erythroseptica, P. nicotianae, P. Cactorum и др.) Върху обикновени растения гостоприемници и в почвата, но в литературата има малко информация за възможността за междувидови хибриди. В лабораторни условия бяха получени хибриди между P. infestans и P. Mirabilis (Goodwin and Fry, 1994).
Таблица 9. Делът на щамовете P. infestans с тип чифтосване А2 в различни страни по света в периода от 1990 до 2000 г. (по данни на отворени литературни източници и сайтове www.euroblight.net, www.eucablight.org)
Страна | 1990 | 1991 | 1992 | 1993 | 1994 | 1995 | 1996 | 1997 | 1998 | 1999 | 2000 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Беларус | 33 (12) | 34 (29) | |||||||||
Белгия | 15 (49 *) | 6 (66) | 20 (86) | ||||||||
Еквадор | 0 (13) | 0 (12) | 0 (19) | 0 (21) | 12 (41) | 25 (39) | 15 (75) | 22 (73) | 25 (68) | 0 (35) | |
Естония | 8 (12) | ||||||||||
Англия | 4 (26) | 3 (630) | 9 (336) | ||||||||
Финландия | 0 (15) | 19 (117) | 12 (16) | 21 (447) | 6 (509) | 9 (432) | 43 (550) | ||||
Франция | 0 (35) | 0 (56) | 0 (83) | 0 (67) | 0 (86) | 2 (135) | 7 (156) | 6 (123) | 0 (73) | 0 (285) | 0 (135) |
Унгария | 72 (32) | ||||||||||
Ирландия | 4 (145) | ||||||||||
Север. Ирландия | 10 (41) | 9 (58) | 1 (106) | 0 (185) | 0 (18) | 0 (56) | 0 (35) | 0 (26) | |||
Холандия | 7 (41) | 5 (276) | 24 (377) | 44 (353) | 23 (185) | ||||||
Норвегия | 25 (446) | 28 (156) | 8 (39) | 18 (257) | 38 (197) | ||||||
Перу | 0 (34, 1984 -86) | 0 (287, 1997-98) | 0 (112) | 0 (66) | |||||||
Польша | 19 (180) | 21 (142) | 33 (256) | 26 (149) | 35 (70) | ||||||
Шотландия | 25 (147) | 11 (163) | 22 (189) | 5 (22) | |||||||
Швеция | 25 (263) | 62 (258) | 49 (163) | ||||||||
Уелс | 0 (16) | 7 (97) | 0 (48) | 0 (25) | |||||||
Корея | 36 (42) | 10 (130) | 15 (98) | ||||||||
Китай | 20 (142, 1995-98) | 0 (6) | 0 (8) | 0 (35) | |||||||
Колумбия | 0 (40, 1994-2000) | ||||||||||
Уругвай | 100 (25, 1998-99) | ||||||||||
Марокко | 60 (108, 1997-2000) | 52 (25) | 42 (40) | ||||||||
Сербия | 76 (37) | ||||||||||
Мексико (Толука) | 28 (292, 1988-89) | 50 (389, 1997-98) |
Таблица 10. Делът на щамовете P. infestans с тип чифтосване А2 в различни страни по света в периода от 2000 до 2011 г.
Страна | 2001 | 2002 | 2003 | 2004 | 2005 | 2006 | 2007 | 2008 | 2009 | 2010 | 2011 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Австрия | 65 (83) | ||||||||||
Беларус | 42 (78) | ||||||||||
Белгия | 20 (102 *) | 4 (32) | 50 (14) | 25 (16) | 62 (13) | 54 (26) | 70 (54) | 30 (23) | 29 (35) | 62 (71) | 45 (49) |
Швейцария | 89 (19) | ||||||||||
Чехия | 35 (31) | 54 (64) | 38 (174) | 12 (80) | |||||||
Германия | 95 (53) | ||||||||||
Дания | 48 (52) | ||||||||||
Еквадор | 5 (178) | 6 (108) | 9 (121) | 18 (94) | 2 (44) | 0 (66) | 5 (47) | ||||
Естония | 54 (25) | 0 (24) | 33 (62) | 45 (140) | 25 (100) | 12 (103) | |||||
Англия | 4 (47) | 10 (96) | 31 (55) | 55 (790) | 68 (862) | 70 (552) | 68 (299) | ||||
Финландия | 47 (162) | 12 (218) | 42 | ||||||||
Франция | 0 (186) | 4 (108) | 8 (61) | 22 (103) | 33 (303) | 65 (378) | 74 (331) | 75 (125) | 75 (12) | ||
Унгария | 48 (27) | 48 (90) | 9 | 7 | |||||||
Север. Ирландия | 0 (38) | 0 (58) | 0 (40) | 0 (24) | 5 (54) | 0 (18) | 27 (578) | 45 (239) | 36 (213) | 82 (60) | 10 (80) |
Холандия | 66 (24) | 93 (15) | 91 (11) | ||||||||
Норвегия | 39 (328) | 3 (115) | 12 (19) | ||||||||
Перу | 0 (36) | ||||||||||
Польша | 25 (46) | 10 (30) | 85 (20) | 38 (44) | 75 (66) | 55 (56) | 65 (35) | 72 (81) | 85 (21) | ||
Шотландия | 3 (213) | 2 (474) | 24 (135) | 86 (337) | 88 (386) | 74 (172) | |||||
Швеция | 60 (277) | 39 (87) | |||||||||
Словакия | 0 (36) | 14 (26) | 62 (26) | 0 (26) | |||||||
Уелс | 25 (12) | 68 (106) | 80 (88) | 92 (143) | 75 (45) | ||||||
Корея | 46 (26) | ||||||||||
Бразилия | 0 (49) | 0 (30) | |||||||||
Китай | 10 (30) | 0 (6) | 0 (6) | ||||||||
Вьетнам | 0 (294, 2003-04) | ||||||||||
Уганда | 0 (8) |
Динамика на генотипния състав на популациите
Промени в генотипния състав на популациите на P. infestans могат да възникнат под влиянието на миграция на нови клонинги от други региони, земеделски практики (промяна на сортовете, прилагане на фунгициди) и метеорологични условия. Външните влияния засягат по различен начин клонингите на различни етапи от жизнения цикъл; следователно популациите ежегодно изпитват циклични промени в честотите на гените, подлежащи на селекция, поради промяна в доминиращата роля на генния дрейф и селекция.
Влияние на сорта
Новите сортове с ефективни гени за вертикална резистентност (R-гени) са мощен селективен фактор, който селектира клонинги с комплементарни гени на вирулентност в популациите на P. infestans. При липса на неспецифична резистентност при сорта картофи, която инхибира растежа на патогенната популация, процесът на заместване на доминиращите клонове в популацията се случва много бързо. И така, след разпространението в района на Москва на сорта Домодедовски, който има R3 устойчив ген, честотата на клониращите вируленти за този сорт се е увеличила от 0,2 до 0,82 за една година (Dyakov, Derevjagina, 2000).
Промяната в честотата на вирулентните гени (патотипове) в популациите се случва не само под влиянието на култивирани сортове картофи. Например в Беларус до 1977 г. доминираха клонинги с вирулентни гени 1 и 4, което беше причинено от отглеждането на сортове картофи с резистентни гени R1 и R4 (Dorozhkin, Belskaya, 1979). В края на 70-те години на XX век обаче се появяват клонинги с различни вирулентни гени и техните комбинации, а гените на допълнителна резистентност никога не са били използвани при развъждането на картофи (гени с допълнителна вирулентност) (Ivanyuk et al., 2002). Причината за появата на такива клонинги очевидно се дължи на миграцията в Европа на инфекциозен материал от Мексико с картофени клубени. Вкъщи тези клонинги се развиват не само върху култивирани картофи, но и върху диви видове, носещи различни гени на резистентност; следователно комбинацията от много гени на вирулентност в генома е необходима за оцеляване при тези условия.
Що се отнася до сортовете с неспецифична резистентност, те, намалявайки скоростта на възпроизводство на патогена, забавят развитието на неговите популации, което, както вече беше споменато, е функция на броя. Тъй като агресивността е полигенна, клонингите, съдържащи по-голям брой гени за "агресивност", се натрупват, колкото по-бързо, толкова по-голям е популационният размер. Следователно, силно агресивните раси не са продукт на адаптация към култивирани сортове с неспецифична устойчивост, а, напротив, е по-вероятно да бъдат открити в насажденията на силно податливи сортове, които са акумулатори на спорите на паразита.
По този начин в Русия най-агресивните популации на P. Infestans са открити в зони с годишни епифитотии (популации от Сахалин, Ленинград и Брянск). Агресивността на тези популации се оказа по-висока от тази на мексиканските (Filippov et al., 2004).
Освен това в листата на устойчивите сортове се образуват по-малко ооспори, отколкото в податливите (Hanson and Shattock, 1998), тоест неспецифичната устойчивост на сорта също намалява рекомбинационните способности на паразита и възможността за алтернативни методи за зимуване.
Влияние на фунгицидите
Фунгицидите не само намаляват броя на фитопатогенните гъби, т.е. засягат количествените характеристики на техните популации, но те също могат да променят честотата на отделните генотипове, т.е. влияят върху качествения състав на популациите. Сред най-важните показатели на популациите, променящи се под въздействието на фунгициди, са следните: промени в устойчивостта на фунгициди, промени в агресивността и вирулентността и промени в репродуктивните системи.
Влияние на фунгицидите върху устойчивостта и агресивността на популациите
Степента на това влияние се определя преди всичко от вида на използвания фунгицид, който условно може да бъде разделен на полисит, олигозит и монозит.
Първият включва повечето контактни фунгициди. Резистентността към тях (ако изобщо е възможно) се контролира от голям брой много слабо експресивни гени. Тези свойства определят липсата на видими промени в резистентността на популацията след третиране с фунгициди (въпреки че при някои експерименти е получено известно повишаване на резистентността). Гъбичната популация, запазена след пръскане с контактни фунгициди, се състои от две групи щамове:
1) Щамове, запазени в участъци от растения, които не са третирани с лекарството. Тъй като не е имало контакт с фунгицида, агресивността и устойчивостта на тези щамове не се променя.
2) Щамове в контакт с фунгицида, чиято концентрация в точките на контакт е по-ниска от леталната. Както бе споменато по-горе, резистентността на тази част от популацията също не се променя, поради частичното увреждащо действие на фунгицида дори в сублетална концентрация върху метаболизма на гъбичната клетка, общата годност и нейния паразитен компонент, агресивност, намаляване (Derevyagina and Dyakov, 1990).
По този начин дори част от популацията, която не е умряла, изложена на контакт с фунгицида, има слаба агресивност и не може да бъде източник на епифитотика. Следователно внимателното лечение, което намалява честотата на дела на населението, което не е в контакт с фунгицида, е условие за успеха на защитните мерки. Устойчивостта към олигозитови фунгициди се контролира от няколко адитивни гени.
Мутацията на всеки ген води до известно увеличаване на резистентността и общата степен на резистентност се дължи на добавянето на такива мутации. Следователно нарастването на съпротивлението се случва поетапно. Пример за постепенно повишаване на резистентността са мутациите на резистентност към фунгицида диметоморф, който се използва широко за защита на картофите от късна болест. Диметоморфната резистентност е полигенна и добавъчна. Едноетапната мутация леко увеличава съпротивлението.
Всяка следваща мутация намалява целевия размер и, следователно, честотата на следващите мутации (Bagirova et al., 2001). Увеличението на средната резистентност на популацията след многократно третиране с олигозитов фунгицид става постепенно и постепенно. Скоростта на този процес се определя от най-малко три фактора: честотата на мутация на резистентни гени, коефициентът на резистентност (съотношението на леталната доза на резистентен щам спрямо чувствителен) и ефектът от мутациите в резистентните гени върху годността.
Честотата на поява на всяка следваща мутация е по-ниска от предишната, следователно процесът има затихващ характер (Bagirova et al., 2001). Ако обаче в популация се появят рекомбинационни процеси (сексуални или парасексуални), тогава е възможно да се комбинират различни родителски мутации в хибриден щам и да се ускори процесът. Следователно популациите на панмикс придобиват устойчивост по-бързо от агамичните, а при последните популациите, които нямат бариери за вегетативна несъвместимост, по-бързо от популациите, разделени от такива бариери. В тази връзка наличието на щамове в популациите, които се различават по видовете чифтосване, ускорява процеса на придобиване на резистентност към олигозитови фунгициди.
Вторият и третият фактор не допринасят за бързото натрупване на резистентни към диметоморфи щамове в популациите. Всяка следваща мутация приблизително удвоява съпротивлението, което е незначително и в същото време намалява както скоростта на растеж в изкуствена среда, така и агресивността (Bagirova et al., 2001; Stem, Kirk, 2004). Може би затова практически няма устойчиви щамове сред естествените щамове на P. infestans, дори тези, събрани от картофени насаждения, третирани с диметоморф.
Популация, лекувана с олигозитов фунгицид, също ще се състои от две групи щамове: тези, които не са били в контакт с фунгицида и следователно не са променили първоначалните черти (ако сред тази група бъдат открити устойчиви щамове, те няма да се натрупват поради по-високата агресивност и конкурентоспособност на чувствителните щамове), и щамове в контакт с сублетални концентрации на фунгицида. Именно сред последните е възможно натрупването на устойчиви щамове, тъй като тук те имат предимства пред чувствителните.
Следователно, когато се използват олигозитни фунгициди, е важно не толкова задълбоченото лечение, колкото високата концентрация на лекарството, няколко пъти по-висока от леталната доза, тъй като при поетапната мутагенеза първоначалната резистентност на мутиралите щамове е ниска.
И накрая, мутациите в резистентност към монозитови фунгициди са силно изразени, т.е. една мутация може да отчете високо ниво на резистентност, до пълна загуба на чувствителност. Следователно нарастването на устойчивостта на популациите се случва много бързо.
Пример за такива фунгициди са фениламидите, включително най-често срещаният фунгицид, металаксил. Мутациите на резистентност към него се проявяват с висока честота, а степента на резистентност при мутантите е много висока - тя надвишава чувствителния щам с хиляда или повече фактора (Derevyagina et al., 1993). Въпреки че скоростта на растеж и агресивността на резистентните мутанти намалява на фона на смъртта на чувствителни щамове от системен фунгицид, броят на резистентната популация нараства бързо и нейната агресивност нараства паралелно. Следователно, след няколко години използване на фунгицида, агресивността на резистентните щамове може не само да се изравни с агресивността на чувствителните, но и да я надмине (Derevyagina, Dyakov, 1992).
Въздействие върху сексуалната рекомбинация
Тъй като честото появяване на тип чифтосване А2 в популациите на P. infestans съвпада с интензивното използване на металаксил срещу късна болест, се предполага, че металаксилът предизвиква конвертиране на типа на чифтосване. В P. parasitica такова превръщане под действието на хлоронеб и металаксил е доказано експериментално (Ko, 1994). Еднократно преминаване върху среда с ниска концентрация на металаксил доведе до появата на хомотални изолати от щам на P. infestans, чувствителен към металаксил с чифтосване тип А1 (Savenkova and Cherepnikova-Anikina, 2002). По време на следващите пасажи върху среда с по-висока концентрация на металаксил не се открива нито един изолат от типа сдвояване А2, но повечето изолати, когато се кръстосват с изолати А2, вместо ооспори, образуват грозни натрупвания на мицел и са стерилни. Пасажите на устойчив щам с тип чифтосване А2 върху среда с висока концентрация на металаксил ни позволи да открием три форми на промени в типа на чифтосване: 1) пълна стерилност при кръстосване с изолати А1 и А2; 2) хомотализъм (образуването на ооспори в монокултура); 3) преобразуване на тип чифтосване А2 в А1. По този начин металаксилът може да причини промени в видовете чифтосване в популациите на P. infestans и съответно сексуална рекомбинация в тях.
Влияние върху вегетативната рекомбинация
Някои гени на резистентност към антибиотици увеличават честотата на хифална хетерокариотизация и ядрена диплоидизация (Poedinok and Dyakov, 1981). Както беше отбелязано по-рано, хетерокариотизацията на хифи по време на сливане на различни щамове на P. infestans се случва много рядко поради феномена на вегетативна несъвместимост при тази гъба. Гените за резистентност към някои антибиотици обаче могат да имат странични ефекти, изразяващи се в преодоляване на вегетативната несъвместимост. Това свойство се притежава от 1S-1 мутантния ген на резистентност към стрептомицин. Наличието на такива мутанти в полевите популации на фитофтора може да увеличи потока на гени между щамове и да ускори адаптацията на цялата популация към нови сортове или фунгициди.
Някои фунгициди и антибиотици могат да повлияят на честотата на митотична рекомбинация, което също може да промени честотата на генотипа в популациите. Широко използваният фунгицид беномил се свързва с бета-тубулин, протеин, от който се изграждат микротубулите на цитоскелета и по този начин нарушава процесите на разделяне на хромозомите в анафазата на митозата, увеличавайки честотата на митотичната рекомбинация (Hastie, 1970).
Същото свойство има и фунгицидът пара-флуорофенилаланин, използван за лечение на холандска болест при брястове. Пара-флуорофенилаланинът увеличава честотата на рекомбинация при хетерозиготни диплоиди P. infestans (Poedinok et al., 1982).
Циклични промени в генотипния състав на популациите в жизнения цикъл на P. infestans
Класическият цикъл на развитие на P. infestans в умерения пояс се състои от 4 фази.
1) Фаза на експоненциален растеж на популацията (полициклична фаза) с кратки поколения. Тази фаза обикновено започва през юли и продължава 1,5-2 месеца.
2) Фазата на спиране на растежа на популацията поради рязко намаляване на дела на незасегнатата тъкан или настъпване на неблагоприятни метеорологични условия. Тази фаза във фермите, които извършват ранно отстраняване на листа преди прибиране на реколтата, отпада от годишния цикъл.
3) Фазата на зимуване в клубените, придружена от значително намаляване на броя на популацията поради случайно заразяване на клубените, бавното развитие на инфекция в тях, липсата на повторно заразяване на клубените, гниене и бракуване на засегнатите клубени при нормални условия на съхранение.
4) Фаза на бавно развитие в почвата и върху разсад (моноциклична фаза), в която продължителността на генериране може да достигне месец или повече (края на май - началото на юли). Обикновено по това време болните листа са трудни за откриване дори със специални наблюдения.
Фаза на експоненциален прираст на населението (полициклична фаза)
Многобройни наблюдения (Pshedetskaya, Kozubova, 1969; Borisenok, 1969; Osh, 1969; Dyakov, Suprun, 1984; Rybakova, Dyakov, 1990) показват, че в началото на епифитотията преобладават ниско вирулентни и леко агресивни клонинги, които впоследствие се заменят с по-вирулентни и агресивни. темпът на нарастване на агресивността на популацията е колкото по-висок, толкова по-малко устойчив е сортът на растението гостоприемник.
С нарастването на популацията се увеличава концентрацията както на селективно важни гени, въведени в търговските сортове (R1-R4), така и на селективно неутрални (R5-R11). И така, в популациите близо до Москва през 1993 г. средната вирулентност от края на юли до средата на август се е увеличила от 8,2 на 9,4, а най-голямото увеличение се наблюдава за селективно неутралния ген за вирулентност R5 (от 31 на 86% от вирулентните клонинги) (Smirnov, 1996 ).
Намаляването на темповете на растеж на една популация се придружава от намаляване на паразитната активност на популацията. Следователно, в депресивни години, както общият брой на расите, така и делът на силно вирулентните раси са по-ниски, отколкото при епифитотичните (Borisenok, 1969). Ако в разгара на епифитотичните метеорологични условия се променят до неблагоприятни за късна болест и заразяване с картофи, концентрацията на силно вирулентни и агресивни клонинги също намалява (Rybakova et al., 1987).
Увеличението на честотите на гените, влияещи върху вирулентността и агресивността на популацията, може да се дължи на избора на по-вирулентни и агресивни клонинги в смесената популация. За да се демонстрира селекцията, беше разработен метод за анализ на неутрални мутации, който беше успешно използван в хемостатни популации на дрожди (Adams et al., 1985) и Fusarium graminearum (Wiebe et al., 1995).
Честотата на мутантите, резистентни към бластицидин S, в полевата популация на P. infestans намалява паралелно с нарастването на агресивността на популацията, което показва промяна в доминиращите клонинги в процеса на нарастване на популацията (Rybakova et al., 1987).
Фаза на зимуване в грудки
По време на зимуването в картофените клубени вирулентността и агресивността на щамовете P. infestans намаляват и намаляването на вирулентността настъпва по-бавно от агресивността (Rybakova and Dyakov, 1990). Очевидно при условия, благоприятни за бързия растеж на популацията (r-селекция), са полезни гени за „допълнителна“ вирулентност и висока агресивност, поради което развитието на епифитотици е придружено от избора на най-вирулентните и агресивни клонинги. В условията на насищане на околната среда, когато не скоростта на размножаване, а постоянството на съществуването при неблагоприятни условия (К-селекция) играе важна роля, „допълнителните“ гени на вирулентност и агресивност намаляват фитнеса, а клонингите с тези гени измират първите, така че средната агресивност и вирулентността на населението пада.
Вегетационна фаза в почвата
Тази фаза е най-загадъчната в жизнения цикъл (Andrivon, 1995). Неговото съществуване се постулира чисто спекулативно - поради липсата на информация за това какво се случва с патогена в продължение на дълъг период (понякога повече от месец) - от появата на картофени разсад до появата на първите петна от болестта върху тях. Въз основа на наблюдения и експерименти беше реконструирано поведението на гъбата през този период от живота (Hirst and Stedman, 1960; Boguslavskaya, Filippov, 1976).
Спорообразуването на гъбичките може да се образува върху заразени грудки в почвата. Получените спори покълват с хифи, които могат да вегетират дълго в почвата. Първичните (образувани върху грудки) и вторичните (върху мицела в почвата) спори се издигат на повърхността на почвата чрез капилярни течения, но придобиват способността да заразяват картофите само след като долните му листа слязат и влязат в контакт с повърхността на почвата. Такива листа (а именно първите петна от болестта се откриват върху тях) не се образуват веднага, а след продължителен растеж и развитие на картофените върхове.
По този начин в жизнения цикъл на P. infestans може да съществува и фазата на сапротрофна вегетация. Ако в паразитната фаза на жизнения цикъл агресивността е най-важният компонент на фитнеса, то в сапротрофната фаза селекцията е насочена към намаляване на паразитните свойства, както експериментално е показано за някои фитопатогенни гъби (вж. Carson, 1993). Следователно в тази фаза на цикъла агресивните свойства трябва да се губят най-интензивно. Но досега не са провеждани директни експерименти за потвърждаване на горните предположения.
Сезонните промени засягат не само патогенните свойства на P. infestans, но и устойчивостта към фунгициди, която нараства в полицикличната фаза (по време на епифитотии) и намалява през зимното съхранение (Derevyagina et al., 1991; Kadish and Cohen, 1992). Особено интензивен спад на устойчивостта към металаксил се наблюдава в периода между засаждането на засегнатите клубени и появата на първите петна от болестта в полето.
Вътревидна специализация и нейната еволюция
P. infestans причинява епидемии в две търговски важни култури, картофи и домати. Епифитотиите върху картофите започнаха скоро след навлизането на гъбичките в нови области. Поражението на доматите също се забелязва малко след появата на инфекция върху картофите, но епифитотиите по доматите се забелязват само сто години по-късно - в средата на XNUMX век. Ето какво пишат Халели и Нидерхаузер за поражението на доматите в САЩ
(1962): „За около 100 години след тежката епифитотия от 1845 г. не са правени малко или почти никакви опити за получаване на устойчиви сортове домати. Въпреки че късната болест е регистрирана за пръв път при доматите още през 1848 г., тя не става обект на сериозно внимание на животновъдите на това растение до силно огнище на болестта през 1946 г. На територията на Русия късната болест на доматите е регистрирана през 60 век. „Дълго време изследователите не обръщаха внимание на това заболяване, тъй като то не причини значителни икономически щети. Но през 70-те и 1979-те. Епифитотии на XX век от късна болест върху домати се наблюдават и в Съветския съюз, главно в района на Долна Волга, в Украйна, Северен Кавказ, в Молдова ... ”(Балашова, XNUMX).
Оттогава доматената болест от късна болест става ежегодна, разпространява се на цялата територия на индустриално и домашно отглеждане и причинява огромни икономически щети на тази култура. Какво стана? Защо първата поява на паразита върху картофите и епифитозната лезия на тази култура са се появили почти едновременно и защо е необходим един век, за да се появи епифитозата върху домата? Тези различия подкрепят мексикански, а не южноамерикански източник на инфекция. Ако видът Phytophthora infestans се формира като паразит на мексикански клубеноносен вид от рода Solanum, тогава е разбираемо защо култивираният картоф, принадлежащ към същия участък от рода като мексиканския вид, е бил толкова силно засегнат, но поради липсата на съвместна еволюция с паразита, който не е развил механизми на специфична и неспецифична устойчивост.
Доматът принадлежи към различен раздел от рода, видът на неговия обмен има значителни разлики от грудковите видове, следователно, въпреки факта, че доматът не е извън хранителната специализация на P. infestans, интензивността на неговото поражение е недостатъчна за сериозни икономически загуби.
Появата на епифитотии върху домат се дължи на сериозни генетични промени в паразита, които увеличиха неговата годност (патогенност) по време на паразитизъм. Ние вярваме, че новата форма, специализирана за паразитиране на домата, е расата Т1, описана от М. Gallegly, засягаща сортовете чери домати (Red Cherry, Ottawa), устойчиви на расата T0, широко разпространена върху картофите (Gallegly, 1952). Очевидно мутация (или поредица от мутации), която превърна расата Т0 в раса Т1 и доведе до появата на клонинги, силно адаптирани към поражението на домата. Както често се случва, повишаването на патогенността за един гостоприемник е придружено от намаляване на него до друг, т.е. възниква първоначална, все още не пълна вътрешновидова специализация - към картофи (раса Т0) и до домати (раса Т1).
Какви са доказателствата за това предположение?
- Поява на картофи и домати. При доматните листа преобладава расата Т1, докато при картофените листа е рядкост. Според С. Ф. Багирова и Т.А. Орешонкова (непубликувана) в Московска област през 1991-1992 г., появата на расата Т1 в картофените насаждения е 0%, а в доматите - 100%; през 1993-1995 г. - съответно 33% и 90%; през 2001 г. - 0% и 67%. Подобни данни бяха получени в Израел (Cohen, 2002). Експерименти с инфекция на картофени клубени с изолати от расата Т1 и смес от изолати Т0 и Т1 показаха, че изолатите от расата Т1 са слабо запазени в клубените и се заменят с изолати от расата Т0 (Dyakov et al., 1975; Rybakova, 1988).
2) Динамика на раса Т1 при засаждането на домати. Първичната инфекция на листата от домати се извършва от изолати от расата Т0, които доминират при анализа на инфекцията в първите петна, образувани върху листата. Това потвърждава общоприетата схема за миграция на паразитите: Основната маса инфекция от картофи се състои от расата Т0, но малък брой клонове Т1, запазени в картофите, веднъж на домата, изместват расата Т0 и се натрупват към края на епифитния период. Възможно е също така да има алтернативен източник на заразяване на листата от домати с расата Т1, не толкова мощен като картофените клубени и листа, но постоянен. Следователно този източник има слаб ефект върху генетичната структура на популацията, заразяваща домати, но впоследствие определя натрупването на расата Т1 (Rybakova, 1988; Dyakov et al., 1994).
3) Агресивност към картофи и домати. Изкуственото заразяване на листа от домати и картофи с изолати от раси Т0 и Т1 показа, че първите са по-агресивни за картофи, отколкото за домати, а вторите са по-агресивни за домати, отколкото за картофи. Тези различия се проявяват в изместването на изолати от не „собствена“ раса от смесена популация по време на пасажи върху листа в оранжерия (Dyakov et al., 1975) и в полеви парцели (Leberton et al., 1999); разлики в минималното инфекциозно натоварване, латентния период, размера на инфекциозните петна и производството на спори (Rybakova, 1988; Dyakov et al., 1994; Legard et al., 1995; Forbes et al., 1997; Oyarzun et al., 1998; Leberton et al. al., 1999; Vega-Sanchez et al., 2000; Knapova, Gisi, 2002; Sussuna et al., 2004).
Агресивността на изолатите от расата Т1 към сортовете домати, при които липсват резистентни гени, е толкова висока, че тези изолати спорят върху листата, както върху хранителна среда, без да некротизират заразената тъкан (Dyakov et al., 1975; Vega-Sanchez et al., 2000).
4) Вирулентност за картофи и домати. Расата Т1 засяга сортовете чери домати с ген на резистентност Ph1, докато расата Т0 не е в състояние да зарази тези сортове, т.е. има по-тясна вирулентност. По отношение на диференциаторите
R-гените на картофите са обратно свързани, т.е. щамовете, изолирани от листата на доматите, са по-малко вирулентни от щамовете "картофи" (Таблица 11).
5) Неутрални маркери. Анализът на неутрални маркери в популациите на P. infestans, паразитиращи върху картофи и домати, също свидетелства за многопосочната вътреспецифична селекция. В бразилските популации на P. infestans изолатите от домати принадлежат към клоналната линия US-1, а тези от картофени листа към BR-1 (Suassuna et al., 2004). Във Флорида (САЩ) от 1994 г. клонингът US-90 започва да доминира върху картофите (с честота над 8%), а клонингите US-11 и US-17 върху доматите, а изолатите на последния са по-агресивни за домати, отколкото за картофи (Weingartner , Tombolato, 2004). Установени са значителни разлики в честотите на генотипа (ДНК пръстови отпечатъци) в картофени и доматни изолати за 1200 щама P. infestans, събрани в САЩ от 1989 до 1995 г. (Deahl et al., 1995).
Използването на метода AFLP направи възможно отделянето на 74 щама, събрани от картофи и листа от домати през 1996-1997 г. във Франция и Швейцария, в 7 групи. Щамовете картофи и домати не се различават ясно, но щамовете "картофи" са генетично по-разнообразни от "доматите". Първите бяха открити във всички седем клъстера, а вторите - само в четири, което показва по-специализиран геном на вторите (Кнапова и Гиси, 2002).
6) Механизми на изолация. Ако популациите на паразита на два вида растения гостоприемници еволюират към стесняване на специализацията към техния „собствен” гостоприемник, тогава възникват различни пре- и постмейотични механизми, които предотвратяват междупопулационен генетичен обмен (Дяков и Лекомцева, 1984).
Няколко проучвания са изследвали влиянието на източника на родителски щамове върху ефективността на хибридизацията. Когато щамове, изолирани от различни видове от рода Solanum, бяха кръстосани в Еквадор (Oliva et al., 2002), беше установено, че щамове с тип чифтосване А2 от диви нощници (клонална линия EC-2) преминават най-зле с щамове от домат (линия EC -3) и най-ефективно се кръстосва с картофения щам (EC-1).
Установено е, че всички хибриди са непатогенни. Авторите смятат, че ниският процент на хибридизация и намаляването на патогенността при хибридите се дължи на постмейотичните механизми на репродуктивна изолация на популациите.
В експериментите на Bagirova et al. (1998) голям брой щамове картофи и домати бяха кръстосани със свойствата на расите T0 и T1. Най-високо плодородни са кръстоски на щамове T1xT1, изолирани от домати (36 ооспори в зрителното поле на микроскопа, 44% от кълняемостта на ооспорите), най-малко ефективни са били кръстоски на раси T0xT1, изолирани от различни гостоприемници (малък брой развиващи се и покълнали ооспори, висок процент на аборти и недоразвити оспори) ... Ефективността на кръстосванията между изолати от расата Т0, изолирани от картофи, е била междинна. Тъй като основната маса щамове от расата Т0 засяга картофите, тя има надежден източник на зимуване - картофени клубени, в резултат на което значението на ооспорите като зимуващи инфекциозни единици за популациите от картофи е ниско. Адаптираната "форма на домат" е в състояние да зимува върху домата под формата на ооспори (виж по-долу) и следователно запазва по-висока производителност на половия процес. Поради високата си плодовитост, Т1 придобива независим потенциал за първична инфекция в домата. Резултатите, получени от Knapova et al. (Knapova et al., 2002), могат да бъдат интерпретирани по същия начин. Кръстовете на щамове, изолирани от картофи с щамове от домати, дават най-голям брой ооспори - 13,8 на кв. Мм. средна (с разпространение 5-19) и междинен процент на покълване на ооспорите (6,3 с разпространение 0-24). Пресичането на щамове, изолирани от домати, дава най-нисък процент на ооспори (7,6 с разпространение 4-12) с най-висок процент на покълване (10,8). Кръстосването между щамовете, изолирани от картофи, дава междинен брой ооспори (8,6 с голямо разсейване на данните - 0-30) и най-нисък процент на покълване на ооспори (2,7). По този начин щамовете от картофи са по-малко плодородни от тези от доматите, но кръстосаните интерпопулации не дават по-лоши резултати от интрапопулационните. Възможно е разликите с горните данни на Bagirova et al. се обясняват с факта, че руските изследователи са работили с щамове, изолирани в началото на 90-те години на 90-ти век, а швейцарски изследователи - с щамове, изолирани в края на XNUMX-те години.
Основата за ниска плодовитост може да бъде хетероплоидията на щамовете. Ако в мексиканските популации, където сексуалният процес и първичната инфекция с потомство на ооспори са редовни, повечето от изследваните щамове на P. Infestans са диплоидни, то в страните от Стария свят се наблюдава полиповизъм на плодовия интрапопулационен (ди-, три- и тетраплоидни щамове, както и хетерокариотни щамове с хетероплоидни ядра) и щамове, имащи различни видове чифтосване, т.е. взаимно плодовити, различават се по ядрена плоидия (Therrien et al., 1989, 1990; Whittaker et al., 1992; Ritch, Daggett, 1995). Разнообразието от ядра в антеридия и оогония може да е причина за ниска плодовитост.
Що се отнася до ядрения обмен между хифи по време на анастомози, това се предотвратява от вегетативна несъвместимост, която разделя безполовите популации на много генетично изолирани клонинги (Poedinok and Dyakov, 1987; Gorbunova et al., 1989; Anikina et al., 1997b).
7) Сближаване на популациите. Горните данни показват, че е възможна хибридизация между щамовете на P. infestans от "картофи" и "домати". Възможна е и реципрочна реинфекция на различни гостоприемници, макар и с намалена агресивност.
Изследване на маркери на популацията в изолати от съседни полета с картофи и домати през 1993 г. показва, че около една четвърт от изолатите, изолирани от листата на домати, са пренесени от съседно картофено поле (Dolgova et al., 1997). Теоретично може да се приеме, че разминаването на популациите на два гостоприемника ще се увеличи и ще доведе до появата на специализирани вътревидови форми (f.sp. картофи и f.sp. домати), особено след като ооспорите могат да продължат да съществуват в растителните остатъци (Drenth et al., 1995 ; Багирова, Дяков, 1998) и семена от домати (Rubin et al., 2001). Следователно доматите понастоящем имат източник на пролетно регенериране, независимо от картофените клубени.
Всичко обаче се случи по различен начин. Презимуването с ооспори позволи на паразита да избегне най-тесния етап от своя жизнен цикъл - моноцикличния етап на вегетация в почвата, през който паразитните свойства намаляват, които постепенно се възстановяват в полицикличната фаза през лятото.
Таблица 11. Честота на вирулентни гени към сортове диференциращи картофи в щамове P. infestans
Страна | Година | Среден брой гени на вирулентност в щамове | Автор | |
от картофи | от домат | |||
Франция | 1995 | 4.4 | 3.3 | Leberton et al., 1999 |
1996 | 4.8 | 3.6 | Leberton, Andrivon, 1998 | |
Франция, Швейцария | 1996-97 | 6.8 | 2.9 | Кнапова, Гиси, 2002 |
САЩ | 1989-94 | 5 | 4.8 | Гудуин и др., 1995 |
САЩ, Зап. Вашингтон | 1996 | 4.6 | 5 | Dorrance et al., 1999 |
1997 | 6.3 | 3.5 | " | |
Еквадор | 1993-95 | 7.1 | 1.3 | Oyarzun et al., 1998 |
Израел | 1998 | 7 | 4.8 | Коен, 2002 |
1999 | 6 | 5.7 | " | |
2000 | 6.7 | 6.1 | " | |
Русия, Москва. регион | 1993 | 8.9 | 6.7 | Смирнов, 1996г |
Русия, различни региони | 1995 | 9.4 | 8 | Козловская и други. |
1997 | 9.2 | 9.2 | " | |
2000 | 8.7 | 4.8 | " |
Първичните зооспорангии и зооспори, които покълват ооспори, имат висока степен на паразитна активност, особено ако ооспорите са се образували партеногенетично под въздействието на феромони от щам с противоположен тип чифтосване. Следователно инфекциозният материал върху разсад от домати, отглеждани от семена, заразени с ооспори, е силно патогенен както за домати, така и за картофи.
Тези промени доведоха до ново преструктуриране на населението, изразено в следните важни промени от епидемиологична гледна точка:
- Заразените разсад от домати се превърнаха във важен източник на първична инфекция на картофите (Филипов, Иванюк, лични съобщения).
- Епифитотии върху картофи започнаха да се наблюдават още през юни, около месец по-рано от обикновено.
- При картофените насаждения процентът на расата Т1 се е увеличил, което преди е било установено там в незначително количество (Ulanova et al., 2003).
- Щамовете, изолирани от листата на доматите, вече не се различават от картофените щамове по вирулентност върху картофените диференциатори на вирулентните гени и започват да надминават „картофените“ щамове по агресивност не само върху доматите, но и върху картофите (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al. , 2003).
По този начин, вместо разминаване, имаше сближаване на популациите, появата на една популация върху две растения гостоприемници с висока вирулентност и агресивност към двата вида.
Заключение
Така че, въпреки повече от 150 години интензивно изучаване на P. infestans, в биологията, включително популационната биология на този причинител на най-важните болести на култивираните пасищни растения, много остава неизвестно. Не е ясно как преминаването на отделни етапи от жизнения цикъл влияе върху структурата на популациите, какви са генетичните механизми на канализираната променливост на агресивността и вирулентността, какво е съотношението на репродуктивната и клоновата система на възпроизводство в естествените популации, как се наследява вегетативната несъвместимост, каква е ролята на картофите и доматите при първичната инфекция на тези култури и какъв е техният ефект върху популационната структура на паразита. Досега не са разрешени такива важни практически въпроси като генетичните механизми за промяна на агресивността на паразита или ерозията на неспецифична картофена устойчивост. С задълбочаването и разширяването на научните изследвания върху картофената болест паразитът създава нови предизвикателства пред изследователите. Подобряването на експерименталните способности, появата на нови методологични подходи за манипулация с гени и протеини ни позволяват да се надяваме на успешно решение на поставените въпроси.
Статията е публикувана в списание "Защита на картофите" (№ 3, 2017)